Разработка и применение биофизических анализов для оценки образования тройных комплексов, индуцированных протеолизом, нацеленным на химеры (PROTACS)

Summary

В данной работе мы описываем протоколы биофизической характеристики образования тройных комплексов, индуцированных протеолизом, нацеленным на химеры (PROTACS), в которых участвуют убиквитин-лигазы фон Хиппеля-Линдау E3-лигазы (VHL) и цереблона (CRBN). Биофизические методы, проиллюстрированные здесь, включают поверхностный плазмонный резонанс (SPR), биослойную интерферометрию (BLI) и изотермическую титрованную калориметрию (ITC).

Abstract

Е3-лигазы и белки, предназначенные для деградации, могут быть индуцированы для образования комплексов гетеробифункциональными молекулами в многоступенчатом процессе. Кинетика и термодинамика взаимодействий способствуют эффективности убиквитинирования и, как следствие, деградации белка. Биофизические методы, такие как поверхностный плазмонный резонанс (SPR), биослойная интерферометрия (BLI) и изотермическая титровательная калориметрия (ITC), предоставляют ценную информацию, которую можно использовать для оптимизации этих взаимодействий. С помощью двух модельных систем был создан биофизический инструментарий для понимания кооперативности формирования тройных комплексов и влияния «эффекта крюка» на кинетику связывания. В одном случае был оценен протеолиз, нацеленный на молекулу химеры (PROTAC), которая индуцировала образование тройного комплекса между Brd4^BD2 и VHL. Гетеробифункциональная молекула MZ1 обладает нМ сродством как к белку Brd4^BD2 (SPR K D = 1 нМ, ITC K D = 4 нМ), так и к комплексу VHL (SPR K D = 29 нМ, ИТК K _D = 66 нМ). Для этой системы были разработаны надежные анализы SPR, BLI и ITC, которые воспроизводили опубликованные результаты, демонстрирующие кооперативность образования тройных комплексов. В другом случае была изучена молекула, которая индуцировала тройные комплексы между белком PPM1D с молекулярной массой 46,0 кДа и цереблоном [CRBN (319-442)]. Гетеробифункциональная молекула BRD-5110 имеет SPR K_D = 1 нМ для PPM1D, но гораздо более слабое связывание с усеченным комплексом CRBN (319-442) (SPR K_D= ~ 3 мкМ). В этом случае связывание CRBN в SPR не насыщалось, что приводило к «хуковому эффекту». Была проведена оценка требований к пропускной способности и реагентам для SPR, BLI и ITC, а также даны общие рекомендации по их применению к проектам PROTAC.

Introduction

Полиубиквитинирование белков в клетке является жестко регулируемым процессом, в котором участвуют ферменты семейства убиквитин-лигаз ^1,2. Концевыми ферментами в этом пути являются убиквитин-лигазы E3, которые ковалентно присоединяют молекулы убиквитина к своим белок-связывающим партнерам³. Полиубиквитинирование этих партнеров, связывающих белки, нацелено на их протеолитическую деградацию протеасомой⁴. Эта система является частью процесса белкового гомеостаза, который был терапевтически использован для индукции деградации белков, участвующих в заболевании

Protocol

Все белки были гиперэкспрессированы в E.coli с хорошей продуктивностью и чистотой (>80%) в соответствии с литературными протоколами¹⁸. Биотинилирование проводили с помощью BirA-катализируемой реакции¹⁸. Все малые молекулы получали в исходных растворах 1 мМ в 100% Д?.......

Discussion

Биофизическая характеристика бинарных и троичных взаимодействий между молекулами PROTAC и их партнерами по связыванию с белками может дать уникальную и дополняющую информацию о широко используемых клеточных системах. Понимание сродства между каждой боеголовкой молекулы PROTAC и ее партн?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-plate	Greiner	655076	flat-bottom, black plates used In BLI experiments
96-well plate	Nunc	73520-120	Plate use for ITC sample preparation
96-well plate	Greiner	650101	Plate used to prepare samples for SPR experiments
Auto iTC200 micro-calorimeter	Malvern Panalytical		Instrument used to perform ITC experiments. Product discontinued.
Biacore S200	Cytiva	29136649	Instrument used to perform SPR experiments
MZ1	ProbeChem	PC-60099	PROTAC that binds to VHL and Brd4BD2
NTA sensor chip	Cytiva	BR100532	SPR chip used to perform SPR experiments involving PPM1D
Octet Red-384	Sartorius		Instrument used to perform BLI experiments. Product discontinued.
Plate cover	Malvern	PQA0001	Cover for Nunc 96-well plate (73520-120)
Plate cover	Cytiva	28975816	Plate cover for Greiner plate (650101)
Series S SA sensor chip	Cytiva	BR100531	SPR chip used to perform SPR experiments involving MZ1:VHL:BRD4
Streptavidin (SA) Dip and Read Biosensors	Sartorius	18-509	Coated sensors used in BLI experiments