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Summary

L'integrazione di organoidi intestinali canini e di un sistema microfluidico Gut-on-a-Chip offre modelli traslazionali rilevanti per le malattie intestinali umane. I protocolli presentati consentono la morfogenesi 3D e la modellazione dinamica in vitro dell'intestino, aiutando nello sviluppo di trattamenti efficaci per le malattie intestinali nei cani e negli esseri umani con One Health.

Abstract

L'intestino canino possiede somiglianze in anatomia, microbiologia e fisiologia con quelli degli esseri umani e i cani sviluppano naturalmente disturbi intestinali spontanei simili agli esseri umani. Il superamento della limitazione intrinseca degli organoidi tridimensionali (3D) nell'accesso alla superficie apicale dell'epitelio intestinale ha portato alla generazione di colture monostrato bidimensionali (2D), che espongono la superficie luminale accessibile utilizzando cellule derivate dagli organoidi. L'integrazione di questi organoidi e di colture monostrato derivate da organoidi in un sistema microfluidico Gut-on-a-Chip ha ulteriormente evoluto la tecnologia, consentendo lo sviluppo di modelli intestinali dinamici in vitro fisiologicamente più rilevanti.

In questo studio, presentiamo un protocollo per la generazione di morfogenesi 3D dell'epitelio intestinale canino utilizzando campioni di tessuto intestinale primario ottenuti da cani affetti da malattie infiammatorie intestinali (IBD). Descriviamo anche un protocollo per la generazione e il mantenimento di colture monostrato 2D e sistemi intestine-on-a-chip utilizzando cellule derivate dagli organoidi intestinali 3D. I protocolli presentati in questo studio fungono da quadro di riferimento per la creazione di un sistema microfluidico Gut-on-a-Chip specificamente progettato per i cani. Gettando le basi per questo approccio innovativo, puntiamo ad ampliare l'applicazione di queste tecniche nella ricerca biomedica e traslazionale, allineandoci ai principi della One Health Initiative. Utilizzando questo approccio, possiamo sviluppare modelli dinamici in vitro più fisiologicamente rilevanti per lo studio della fisiologia intestinale sia nei cani che negli esseri umani. Ciò ha implicazioni significative per le applicazioni biomediche e farmaceutiche, in quanto può aiutare nello sviluppo di trattamenti più efficaci per le malattie intestinali in entrambe le specie.

Introduction

La morfogenesi dell'epitelio intestinale è stata ampiamente studiata attraverso modelli animali da laboratorio, che sono costosi, richiedono tempo e non rappresentano accuratamente i processi di sviluppo umano1. Inoltre, i modelli statici convenzionali di coltura cellulare 2D non sono in grado di imitare la complessa organizzazione spaziale di un'architettura epiteliale 3D2. Di conseguenza, è necessario un protocollo per indurre la morfogenesi 3D in vitro utilizzando cellule epiteliali intestinali provenienti da modelli animali rilevanti per l'uomo per far progredire la nostra comprensione dell'architettura epiteliale intestinale.

I cani da compagnia hanno sviluppato un'anatomia intestinale e una composizione del microbioma che sono notevolmente simili agli esseri umani a causa del loro ambiente condiviso e della dieta durante l'addomesticamento3. Oltre a questa somiglianza, sia gli esseri umani che i cani condividono varie morbilità croniche che si pensa siano attribuite alla salute intestinale. I cani, come gli esseri umani, possono sviluppare spontaneamente condizioni croniche come obesità, disfunzione cognitiva, diabete mellito, malattia infiammatoria intestinale (IBD) e adenocarcinoma colorettale 4,5,6,7,8,9,10. Nonostante lo sviluppo e l'uso di cellule epiteliali umane e murine in precedenti studi Gut-on-a-Chip 2,11,12,13,14, l'epitelio intestinale canino non è stato utilizzato fino ad ora. Il nostro nuovo approccio, che utilizza l'epitelio organoide intestinale canino in un sistema di coltura dinamico con una morfogenesi epiteliale 3D, ha implicazioni significative sia per la medicina canina che per quella umana.

I recenti progressi nella coltura di organoidi intestinali hanno portato alla creazione di una coltura di organoidi intestinalicanini 15. Questo sistema di coltura prevede la coltura di cellule staminali intestinali sotto condizionamento morfogeno definito, ottenendo un modello 3D con proprietà auto-rinnovanti derivate da cellule staminali adulte16. Tuttavia, l'esecuzione di saggi di trasporto o cocolture ospite-microbioma pone difficoltà con questo modello 3D a causa della natura chiusa del lume intestinale17. Per risolvere questo problema, i ricercatori hanno generato un monostrato 2D derivato da organoidi intestinali, che consente l'esposizione della superficie luminale18,19. Tuttavia, sia gli organoidi 3D che i monostrati 2D sono mantenuti in condizioni statiche, che non riflettono accuratamente la biomeccanica in vivo del microambiente intestinale. La combinazione della tecnologia degli organoidi canini derivati dal paziente con la morfogenesi 3D in vitro rappresenta un'opportunità per la ricerca traslazionale sulle malattie croniche multifattoriali. Questo approccio consente ai ricercatori di sviluppare trattamenti più efficaci a beneficio sia degli esseri umani che dei cani e di far progredire ulteriormente la ricerca traslazionale, in linea con l'iniziativa One Health, che è un approccio collaborativo che riconosce l'interconnessione della salute umana, animale e ambientale. Promuove la cooperazione interdisciplinare per affrontare le complesse sfide sanitarie e ottenere risultati sanitari ottimali per tutti. Comprendendo le interdipendenze tra esseri umani, animali ed ecosistemi, l'iniziativa mira a mitigare i rischi derivanti da malattie infettive emergenti, degrado ambientale e altri problemi di salute condivisi20,21,22.

Questo protocollo delinea metodi completi per la coltura di cellule epiteliali intestinali canine ottenute da organoidi di pazienti su un microdispositivo Gut-on-a-Chip con una membrana porosa a base di polidimetilsilossano (PDMS). Stabilire la morfogenesi epiteliale 3D integrando organoidi intestinali canini e questa tecnologia Gut-on-a-Chip ci consente di studiare come l'intestino sviluppa e mantiene la sua organizzazione cellulare e la nicchia delle cellule staminali. Questa piattaforma offre una preziosa opportunità per studiare l'impatto delle comunità di microbioma sulla salute dell'intestino e capire come queste comunità generano metaboliti microbici che contribuiscono alla fisiopatologia intestinale14,23. Questi progressi possono ora essere estesi ai campioni intestinali canini, offrendo ai ricercatori l'opportunità di esplorare l'intricata relazione tra il microbioma intestinale e la fisiologia dell'ospite. Ciò apre la strada per ottenere preziose informazioni sui meccanismi alla base della fisiopatologia intestinale e comprendere il potenziale ruolo dei metaboliti microbici sia nella salute canina che in quella umana, nonché in varie condizioni patologiche. Il protocollo utilizzato per il Gut-on-a-Chip canino è riproducibile, il che lo rende un modello sperimentale adatto per la medicina comparata, in quanto questo approccio consente di studiare le interazioni ospite-microbioma, le infezioni da agenti patogeni e gli effetti terapeutici a base di probiotici sia nei cani che negli esseri umani.

Protocol

Lo studio è stato approvato e condotto in conformità con l'Institutional Animal Care and Use Committee della Washington State University (ASAF# 6993). In questo protocollo, abbiamo utilizzato un dispositivo microfluidico Gut-on-a-Chip ben consolidato realizzato in PDMS che è stato fabbricato internamente2 (Figura 1D). I metodi dettagliati di fabbricazione del microdispositivo Gut-on-a-Chip possono essere trovati nei rapporti precedenti 2,24. Questo protocollo dimostra un'integrazione unica di organoidi intestinali e di un sistema microfluidico (Figura 2).

1. Attivazione superficiale di un Gut-on-a-Chip in PDMS

  1. Preparare una soluzione di polietilenimmina (PEI) all'1% aggiungendo 1 mL di soluzione di PEI al 50% in 49 mL di acqua distillata (DI) in una provetta conica da 50 mL. Capovolgere la provetta due o tre volte per mescolare bene la soluzione, quindi filtrare la soluzione utilizzando un filtro per siringa da 0,2 μm.
    NOTA: Conservare a 4 °C.
  2. Preparare una soluzione di glutaraldeide (GA) allo 0,1% aggiungendo 100 μL di soluzione di GA al 50% in 49,9 mL di DI in una provetta conica da 50 mL. Capovolgere la provetta due o tre volte per mescolare bene la soluzione, quindi filtrare la soluzione utilizzando un filtro per siringa da 0,2 μm.
    NOTA: Conservarlo a 4 °C e assicurarsi di proteggerlo dall'esposizione alla luce diretta.
  3. Mettere il dispositivo Gut-on-a-Chip in un forno asciutto impostato a 60 °C e incubarlo per un minimo di 30 minuti per eliminare l'umidità residua.
  4. Esporre il dispositivo Gut-on-a-Chip al trattamento UV e ozono per 60 minuti utilizzando un generatore UV/Ozono.
    NOTA: Per garantire un'attivazione ottimale delle superfici PDMS durante il trattamento, mantenere una distanza di circa 3 cm o meno tra la lampada UV e il dispositivo. Evitare il sovraffollamento dei dispositivi nel generatore per ottenere un'attivazione efficiente della superficie.
  5. Fissare i tubi di ingresso, bypass e uscita del microcanale superiore utilizzando clip di legatura per clamp. Clamp anche il tubo di ingresso per il microcanale inferiore.
  6. Scollegare il tubo di uscita per il microcanale inferiore. Assicurarsi che il tubo di bypass del microcanale inferiore rimanga aperto.
  7. Utilizzando una micropipetta P100, introdurre 100 μL di una soluzione di PEI all'1% attraverso il foro di uscita del microcanale inferiore.
    NOTA: Si consiglia di eseguire questo processo mentre il dispositivo è ancora caldo a causa dell'esposizione ai raggi UV/ozono. Osservare la soluzione di PEI che scorre attraverso il microcanale e la soluzione di PEI che scende per uscire dal tubo di bypass per il microcanale inferiore.
  8. Ricollegare il tubo di uscita per il microcanale inferiore.
  9. Fissare i tubi di ingresso, bypass e uscita del microcanale inferiore utilizzando clip di legatura per clamper. Clamp anche il tubo di ingresso per il microcanale superiore.
  10. Scollegare il tubo di uscita per il microcanale superiore. Assicurarsi che il tubo di bypass del microcanale superiore rimanga aperto.
  11. Utilizzando una micropipetta P100, introdurre 100 μL di una soluzione di PEI all'1% attraverso il foro di uscita del microcanale superiore.
    NOTA: Osservare la soluzione PEI che scorre attraverso il microcanale e la soluzione PEI che fuoriesce dal tubo di bypass per il microcanale superiore.
  12. Ricollegare il tubo di uscita del microcanale superiore.
  13. Una volta riempiti i microcanali superiore e inferiore con una soluzione di PEI all'1%, lasciare incubare il dispositivo a temperatura ambiente (RT) per 10 minuti.
  14. Eseguire i passaggi 1,5-1,12 con una soluzione GA allo 0,1%.
  15. Una volta che entrambi i microcanali superiore e inferiore sono stati riempiti con una soluzione GA allo 0,1%, lasciare incubare il dispositivo a RT per 20 minuti.
  16. Eseguire i passaggi 1.5-1.12 con acqua deionizzata per rimuovere la soluzione di attivazione superficiale in eccesso.
  17. Mettere la patatina in forno asciutto a 60 °C e lasciarla asciugare per una notte.
    NOTA: Assicurarsi di rimuovere le clip di legatura da tutti i tubi per evitare qualsiasi impatto con il tubo. Questo processo di essiccazione è fondamentale per l'attivazione uniforme della superficie del microcanale all'interno del Gut-on-a-Chip12.

2. Rivestimento della matrice extracellulare (ECM) e preparazione del terreno di coltura per la coltura Gut-on-a-Chip

  1. Preparare una miscela ECM con terreno basale organoide in modo che la concentrazione finale di collagene I e Matrigel sia rispettivamente di 60 μg/mL e 2 % (vol/vol).
    NOTA: Preparare 50 μL di miscela ECM per chip intestinale (ad esempio, 20 μL di miscela ECM per ciascun microcanale superiore e inferiore e 10 μL in più). Prepararla il giorno dell'uso e conservare la soluzione a 4 °C o metterla su ghiaccio fino al momento dell'uso.
  2. Estrarre il Gut-on-a-Chip che è stato trattato con UV/Ozono, PEI e GA dal forno a secco.
    NOTA: Ispezionare al microscopio a contrasto di fase per vedere se c'è umidità residua.
  3. Lasciare raffreddare il Gut-on-a-Chip in una cabina di biosicurezza per 10 minuti.
  4. Fissare i tubi di ingresso, bypass e uscita del microcanale superiore utilizzando clip di legatura per clamp. Clamp anche il tubo di ingresso per il microcanale inferiore.
  5. Scollegare il tubo di uscita per il microcanale inferiore.
  6. Utilizzando una micropipetta P100, introdurre 20 μL di miscela ECM attraverso il foro di uscita del microcanale inferiore.
    NOTA: Osservare la miscela ECM che scorre attraverso il microcanale senza alcun intrappolamento di bolle d'aria. Se è presente una bolla d'aria, introdurre un'ulteriore miscela ECM nel microcanale inferiore fino a quando la bolla non è scomparsa.
  7. Ricollegare il tubo di uscita per il microcanale inferiore.
  8. Fissare i tubi di ingresso, bypass e uscita del microcanale inferiore utilizzando clip di legatura per clamper. Clamp anche il tubo di ingresso per il microcanale superiore.
  9. Scollegare il tubo di uscita per il microcanale superiore.
  10. Utilizzando una micropipetta P100, introdurre 20 μL di miscela ECM attraverso il foro di uscita del microcanale superiore.
  11. Ricollegare il tubo di uscita per il microcanale superiore.
  12. Posizionare il chip in un incubatore di CO 2 umidificato con il 5% di CO2 a 37 °C per 1 ora per formare lo strato ECM sulla membrana PDMS trattata con PEI e GA (Figura 3A).
    NOTA: Assicurarsi che tutti i tubi siano clamped durante l'incubazione.
  13. Durante l'incubazione del rivestimento ECM, preparare due siringhe da 1 mL contenenti terreno di semina freddo, che è il terreno di coltura degli organoidi privo di A8301 ma contenente 10 μM Y-27632 e 2,5 μM CHIR99021, come precedentemente riportato in Gut-on-a-Chip derivato da organoidi umani2.
    NOTA: A8301 è stato rimosso dal terreno per migliorare l'attaccamento delle cellule all'ECM rivestito, come riportato in precedenza2. Il giorno 0 della coltura Gut-on-a-Chip richiede solo un flusso di microcanali superiore. Pertanto, preparare una siringa piena per il canale superiore e un minimo di 0,2 mL per il canale inferiore.
  14. Una volta completato il rivestimento ECM, estrarre il chip dall'incubatore e rilasciare il clamp sul tubo di bypass collegato al microcanale inferiore.
  15. Collegare una siringa da 1 ml riempita con il mezzo di semina all'ago con estremità smussata collegata al microcanale inferiore del Gut-on-a-Chip. Introdurre con cautela il mezzo di semina (~50 μL) nel tubo di bypass. Una volta riempito il tubo con il fluido introdotto, fissare il tubo di bypass collegato al microcanale inferiore con una clip di legante.
  16. Rilasciare il clamp del tubo di uscita collegato al microcanale inferiore. Introdurre con cautela il terreno di semina nel microcanale inferiore, consentendogli di fluire agevolmente attraverso il sistema. Fissare il tubo di uscita collegato al microcanale inferiore con una clip legante dopo la perfusione.
  17. Quindi, aprire il tubo di bypass collegato al microcanale superiore.
  18. Collegare una siringa da 1 mL riempita con il mezzo di semina all'ago con estremità smussata collegata al microcanale superiore del Gut-on-a-Chip. Introdurre con cautela il mezzo di semina (~50 μL) nel tubo di bypass. Una volta riempito il tubo con il fluido introdotto, fissare il tubo di bypass collegato al microcanale superiore con una clip di legante.
  19. Rilasciare il tubo di uscita collegato al microcanale inferiore. Introdurre con cautela il terreno di semina nel microcanale superiore, consentendogli di fluire agevolmente attraverso il sistema. Fissare il tubo di uscita collegato al microcanale superiore con una clip per legante dopo la perfusione.

3. Preparazione di cellule organoidi intestinali canine per la semina

NOTA: Per generare il modello Gut-on-a-Chip, in questo protocollo sono stati utilizzati organoidi del colon canino (denominati colonoidi) derivati da cani affetti da IBD. Questi colonoidi sono stati derivati da tre a cinque piccoli frammenti di tessuto del colon sottoposti a biopsia, seguendo un metodo precedentemente riportato15,18. Per ottenere risultati ottimali, è fondamentale utilizzare colonoidi canini che hanno subito un minimo di tre passaggi di coltura per stabilire organoidi stabili adatti alle applicazioni in vitro. Si raccomanda di coltivare i colonoidi canini per una durata di almeno 3-4 giorni per facilitare un'adeguata differenziazione delle cellule multi-lignaggio all'interno degli organoidi, garantendone la maturità funzionale e l'idoneità per i successivi esperimenti nel modello Gut-on-a-Chip. Il limite massimo del passaggio per questo lavoro è inferiore a 20, come indicato da uno studio precedente che ha dimostrato l'inalterazione del fenotipo e del cariotipo in 20 passaggi consecutivi25. La segnalazione di questi donatori è presentata nella Tabella supplementare S1.

  1. Coltura dei colonoidi canini in piastre a 24 pozzetti incorporate in 30 μL di Matrigel 15,18 con terreno di coltura organoide elencato nella Tabella dei materiali, che è modificato dal terreno precedentemente riportato15,26,27. Il terreno condizionato è stato ottenuto coltivando cellule Rspo1 e cellule HEK293 ingegnerizzate per secernere Noggin28.
  2. Scartare il terreno di coltura organoide attraverso l'aspirazione sotto vuoto e introdurre 500 μL di soluzione di recupero cellulare a una temperatura glaciale in ciascun pozzetto. Incubare per 30 minuti a 4 °C.
    NOTA: In genere, tre pozzetti su una piastra di 24 pozzetti di organoidi intestinali canini maturi forniscono una quantità sufficiente di cellule dissociate per seminare un singolo dispositivo Gut-on-a-Chip con 40-50 organoidi/un campo visivo a ingrandimento x10.
  3. Rompere meccanicamente le cupole Matrigel per 5 secondi utilizzando una micropipetta P1000. Successivamente, raccogliere la sospensione di organoidi in una provetta conica da 15 mL.
  4. Centrifugare la provetta conica a 200 × g e 4 °C per 5 minuti, quindi rimuovere il surnatante.
  5. Introdurre 1 mL di proteasi simile alla tripsina a temperatura ambiente, integrata con 10 μM Y-27632, e risospendere il pellet cellulare mediante pipettaggio utilizzando una micropipetta P1000.
  6. Porre la sospensione cellulare a bagnomaria a 37 °C e incubarla per 10 minuti agitando periodicamente la miscela.
  7. Introdurre 5 mL di terreno basale organoide caldo e pipettare energicamente la sospensione cellulare utilizzando una micropipetta P1000 fino a quando non diventa torbida, senza grumi cellulari visibili.
  8. Far passare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare con un cutoff di 70 μm per eliminare eventuali detriti di Matrigel e grandi cluster di cellule.
  9. Centrifugare la provetta conica a 200 × g e 4 °C per 5 minuti, quindi risospendere il pellet nel terreno di semina. Per la semina di un dispositivo Gut-on-a-Chip canino, utilizzare 20 μL di terreno di semina per risospendere il pellet cellulare (ad esempio, utilizzare 20 μL di terreno di semina quando si semina un dispositivo Gut-on-a-Chip).
  10. Modificare la concentrazione di cellule vitali a 1 × 107 cellule/mL con terreno di semina come riportato in precedenza2. Condurre una valutazione della vitalità utilizzando un emocitometro combinando 10 μL della sospensione cellulare con 10 μL di blu di tripano, quindi osservare le cellule al microscopio.
    NOTA: È fondamentale regolare la concentrazione cellulare in modo appropriato per garantire un attacco ottimale delle cellule e la formazione di un monostrato uniforme sulla membrana del chip. Se il numero iniziale di celle è insufficiente, può causare un ritardo o un insuccesso nella creazione di un monostrato confluente. Al contrario, se il numero di cellule è eccessivo, le cellule non aderenti possono aggregarsi in grumi all'interno del canale, portando a effetti di concentrazione indesiderati.

4. Semina e formazione di un monostrato cellulare 2D

  1. Scollegare il tubo di uscita per il microcanale superiore. Assicurarsi che il tubo di bypass del microcanale superiore rimanga aperto. Fissare sia l'ingresso che l'uscita del microcanale inferiore utilizzando clip di legatura per clampi.
  2. Utilizzando una micropipetta P100 o P20, introdurre 20 μL della sospensione cellulare del Protocollo 3 nel foro di uscita del microcanale superiore (Figura 3B Seeding).
  3. Fissare il bypass e il tubo di ingresso del microcanale superiore utilizzando clip di legatura per clamp. Quindi, ricollegare il tubo di uscita al foro di uscita del microcanale superiore, assicurandosi che il tubo rimanga aperto durante tutto il processo per evitare che venga applicata pressione al microcanale superiore. Dopo questo passaggio, fissare lentamente il tubo di uscita del canale superiore utilizzando una clip per legante per clamp.
  4. Verificare al microscopio che le cellule siano distribuite uniformemente in tutto il microcanale superiore.
    NOTA: È importante clamp il tubo per arrestare il movimento del fluido all'interno del canale per consentire condizioni statiche stabili fino al completamento del collegamento della cella desiderato.
  5. Porre il chip in un incubatore a CO2 umidificato a 37 °C.
    NOTA: Le cellule organoidi intestinali canine impiegano circa 3 ore per attaccarsi al rivestimento ECM (Figura 3B Attacco).
  6. Collegare la siringa attaccata al microcanale superiore del Gut-on-a-Chip a una pompa a siringa posizionata all'interno di un incubatore di CO2 .
    NOTA: Sciacquare con cautela il fluido nel microcanale utilizzando la manopola della pompa a siringa e rimuovere le cellule non legate. Esamina il chip al microscopio per assicurarti che tutte le cellule non attaccate siano state effettivamente lavate via.
  7. Avviare il flusso del terreno di coltura a 30 μL/h con il terreno di semina. Questo flusso continuo è inizialmente solo per il microcanale superiore fino alla creazione del monostrato 2D su un Gut-on-a-Chip. Per il microcanale inferiore, lasciare i microcanali clamped e il fluido non lavato.
  8. Dal giorno successivo alla semina delle cellule, sostituire il terreno di coltura con un terreno di coltura organoide, che contiene A8301 e manca di 10 μM Y-27632 e 2,5 μM CHIR99021, dal terreno di semina.
  9. Una volta stabilito il monostrato, avviare il flusso continuo del fluido anche verso il microcanale inferiore. Di solito ci vogliono da 2 a 3 giorni perché le cellule epiteliali organoidi intestinali canini stabiliscano monostrati epiteliali (Figura 3C).

5. Determinazione della morfogenesi 3D nel Gut-on-a-Chip canino

NOTA: Dopo che i monostrati confluenti sono stati formati in Gut-on-a-Chip, è stato introdotto un flusso medio sia del canale superiore che del canale inferiore e del ceppo cellulare per avviare la morfogenesi 3D al monostrato 2D come presentato nella Figura 2.

  1. Introdurre il terreno di coltura organoide sia nei microcanali superiori che in quelli inferiori per avviare lo sviluppo della morfogenesi 3D in un sistema Gut-on-a-Chip. Per ottenere una sollecitazione di taglio di 0,02 dyne/cm2 nel design Gut-on-a-Chip esistente (ad esempio, microcanale di altezza 500 μm), aumentare la portata a 50 μL/h29.
  2. Iniziare il 10% del ceppo cellulare e 0,15 Hz di frequenza, come raccomandato prima del2, utilizzando un bioreattore regolato da computer che applica il ceppo ciclico alle cellule coltivate in vitro. Questo processo applicherebbe l'aspirazione del vuoto al dispositivo Gut-on-a-Chip.
  3. Mantenere queste condizioni di coltura per un minimo di 2 o 3 giorni. La morfogenesi 3D del monostrato intestinale canino di solito si verifica da 2 a 3 giorni dopo l'inizio del flusso del canale durale e dell'aspirazione a vuoto (Figura 3C).

6. Caratterizzazione del Gut-on-a-Chip canino

  1. Imaging di cellule vive
    1. Rimuovere eventuali bolle d'aria nel Gut-on-a-Chip facendo scorrere delicatamente il terreno utilizzando la pompa a siringa.
    2. Scollegare il dispositivo Gut-on-a-Chip dalla pompa a siringa.
      NOTA: Evitare qualsiasi manovra che possa esercitare pressione all'interno del Gut-on-a-Chip.
    3. Posizionare il dispositivo su un microscopio per acquisire immagini dell'epitelio 3D stabilito. Per visualizzare la struttura degli strati epiteliali 3D utilizzando il contrasto di fase, utilizzare obiettivi 10x e 20x (Figura 3C).
  2. Colorazione a immunofluorescenza
    1. Preparare la soluzione bloccante sciogliendo 1 g di BSA in 50 mL di soluzione salina tampone fosfato (PBS) per ottenere il 2% di BSA. Far passare la soluzione attraverso un filtro a siringa da 0,2 μm per la filtrazione. Conservare la soluzione a 4 °C.
    2. Preparare la soluzione permeabilizzante combinando 150 μL di Triton X-100 con 50 mL di soluzione bloccante, ottenendo una concentrazione finale dello 0,3% di Triton X-100. Far passare la soluzione attraverso un filtro a siringa da 0,2 μm per la filtrazione. Conservare la soluzione a 4 °C.
    3. Eseguire la fissazione delle cellule iniettando 100 μL di PFA al 4% sia nel microcanale superiore che in quello inferiore come descritto nei passaggi 2.4-2.11.
    4. Risciacquare le cellule iniettando 100 μL di PBS nei microcanali superiore e inferiore come descritto nei passaggi 2.4-2.11.
    5. Eseguire la permeabilizzazione delle cellule iniettando 100 μL di Tritone allo 0,3% nei microcanali superiori e inferiori come descritto nei passaggi 2.4-2.11. Posizionare il dispositivo a RT per 30 min.
    6. Risciacquare le cellule iniettando 100 μL di PBS nei microcanali superiore e inferiore come descritto nei passaggi 2.4-2.11.
    7. Eseguire il blocco delle cellule per prevenire il legame non specifico iniettando 100 μL di BSA al 2% sia nei microcanali superiori che in quelli inferiori come descritto nei passaggi 2.4-2.11. Posizionare il dispositivo su RT per 1 ora.
    8. Iniettare 20 μL della soluzione anticorpale primaria diluita in BSA al 2% e porla a RT per 3 ore, seguita da incubazione notturna a 4 °C.
      NOTA: Assicurarsi che tutti i tubi siano clamped durante l'incubazione a 4 °C per tutta la notte. La concentrazione di un anticorpo primario deve essere 2-5 volte superiore alla concentrazione raccomandata per la colorazione monostrato o con organoidi 3D (Figura supplementare S1).
    9. Risciacquare le cellule iniettando 100 μL di PBS sia nei microcanali superiore che in quello inferiore, come descritto nei passaggi 2.4-2.11.
    10. Iniettare 20 μL della soluzione anticorpale secondaria diluita in BSA al 2% e porla a RT per 1 ora.
      NOTA: Assicurarsi che tutti i tubi siano clamped durante l'incubazione. A partire da questo passaggio, è necessario schermare la configurazione del dispositivo con un foglio di alluminio per evitare il fotosbiancamento.
    11. Risciacquare le cellule iniettando 100 μL di PBS sia nei microcanali superiore che in quello inferiore, come descritto nei passaggi 2.4-2.11.
    12. Preparare una soluzione combinata per la controcolorazione di F-actina e DAPI (diamidino-2-fenilindolo). Iniettare 20 μL della soluzione combinata nei microcanali superiore e inferiore come descritto nei passaggi 2.4-2.11.
    13. Risciacquare le cellule iniettando 100 μL di PBS nei microcanali superiore e inferiore come descritto nei passaggi 2.4-2.11.
      Eseguire l'imaging a fluorescenza dell'architettura delle cellule epiteliali 3D utilizzando un microscopio a fluorescenza o un microscopio confocale.

7. Funzione di barriera epiteliale

  1. Rimuovere eventuali bolle d'aria nel Gut-on-a-Chip facendo scorrere delicatamente il terreno utilizzando la pompa a siringa. Assicurarsi che tutti i tubi siano aperti durante la misurazione.
  2. Rimuovere il Gut-on-a-Chip dalla pompa a siringa e posizionarlo a RT per almeno 10 minuti.
  3. Rimuovere gli elettrodi Ag/AgCl dalla soluzione di EtOH al 70%.
  4. Posizionare due elettrodi Ag/AgCl rispettivamente nell'ingresso superiore e nell'uscita inferiore per misurare la resistenza dello strato epiteliale utilizzando un multimetro.
  5. Posizionare due elettrodi Ag/AgCl rispettivamente nell'ingresso inferiore e nell'uscita superiore. Riporta la media di questi due valori come valore di resistenza per il Gut-on-a-Chip.
    NOTA: Il TEER del bianco deve essere misurato su un Gut-on-a-Chip con solo rivestimento ECM senza epitelio.
  6. Calcolare il valore della resistenza elettrica transepiteliale (TEER) (kΩ × cm2) può essere calcolato utilizzando l'equazione (1).
    TEER = (Ωt - Ωvuoto) × A (1)
    Dove Ωt è un valore di resistenza misurato in un punto temporale specifico dall'inizio dell'esperimento, Ωbianco è un valore di resistenza misurato in quel momento senza l'epitelio e A è l'area della superficie coperta da uno strato cellulare (circa 0,11 cm2 per questo progetto Gut-on-a-Chip29).
    1. Calcolare il TEER normalizzato utilizzando l'equazione (2).
      TEER = figure-protocol-23672 (2)
      Dove Ω0 è un valore di resistenza al punto temporale di lettura iniziale dell'esperimento, come riportato in precedenza30 (Figura 4C).

Representative Results

Questo protocollo facilita in modo affidabile lo sviluppo spontaneo della morfogenesi intestinale 3D in un sistema Gut-on-a-Chip. Questo approccio utilizza cellule epiteliali intestinali canine ottenute da organoidi intestinali derivati da cani affetti da malattie infiammatorie intestinali (IBD) (Figura 1B). Raggruppamenti occasionali della morfogenesi 3D delle cellule epiteliali intestinali canine possono essere osservati in tutto il microcanale dopo 6-9 giorni di flusso medio (Figura 3C). Questi cambiamenti morfologici possono essere monitorati utilizzando tecniche di contrasto di fase. In questo studio, abbiamo utilizzato organoidi derivati da due cani con diagnosi di IBD. In particolare, la morfogenesi 3D di successo è stata osservata in due repliche biologiche, ciascuna delle quali è stata eseguita con due repliche tecniche. I risultati di questo studio forniscono una base per future indagini che coinvolgono organoidi intestinali derivati da altri donatori canini. Questi risultati dimostrano la potenziale applicabilità e ripetibilità del nostro approccio sperimentale, che è stato precedentemente riportato in campioni umani. Questi risultati forniscono un'ulteriore conferma che la tecnologia Gut-on-a-Chip è applicabile alle cellule epiteliali intestinali canine, come precedentemente riportato con gli studi che utilizzano cellule epiteliali intestinali umane2.

Questo protocollo ha dimostrato che la colorazione a immunofluorescenza può essere utilizzata per valutare la struttura 3D di monostrati derivati da organoidi che hanno formato strutture simili a villi in chip microfluidici utilizzando la microscopia a fluorescenza convenzionale (Figura 4 A,B). Questo protocollo può essere adattato per validare i fenotipi cellulari differenziati e spazialmente organizzati attraverso la colorazione in immunofluorescenza. La visualizzazione di una morfogenesi 3D all'interno di un Gut-on-a-Chip fornisce un'eccellente opportunità per studiare la risposta dell'ospite durante varie interazioni patologiche 14,23,31. Se combinata con cellule epiteliali derivate da donatori pazienti, come precedentemente descritto nell'uomo, questa tecnologia può essere utilizzata per costruire modelli personalizzati di malattie intestinali13. Attraverso l'integrazione dell'imaging in immunofluorescenza con tecniche di visualizzazione mirata dell'RNA come l'ibridazione fluorescente in situ, può essere possibile analizzare visivamente i trascrittomi e i proteomi dell'ospite all'interno di un sistema Gut-on-a-Chip.

Preservare l'integrità della membrana intestinale è fondamentale per mantenere l'omeostasi intestinale e la piattaforma Gut-on-a-Chip offre un prezioso vantaggio consentendo un monitoraggio e una quantificazione precisi di questa funzione cruciale. La misurazione del TEER con la tecnologia Gut-on-a-Chip offre diversi vantaggi. Ad esempio, studi precedenti hanno valutato con successo il TEER durante la co-coltura di cellule intestinali con batteri non patogeni e probiotici32, nonché in condizioni di permeabilità intestinale23. Ciò consente ai ricercatori di studiare l'impatto di diverse condizioni sulla funzione di barriera intestinale e di identificare potenziali interventi per promuovere la salute intestinale.

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Figura 1: Creazione di IBD canine Gut-on-a-Chip derivate dal paziente. (A) Integrazione degli organoidi intestinali derivati dal paziente e della piattaforma Gut-on-a-Chip. La biopsia endoscopica può essere eseguita per isolare le cellule della cripta intestinale per sviluppare organoidi intestinali specifici per il donatore. Le cellule epiteliali possono essere dissociate in singole cellule dagli organoidi, quindi seminate in un Gut-on-a-Chip basato su PDMS e coltivate in un microambiente dinamico unico. (B) Immagini rappresentative di colonoidi di un cane IBD. Barra di scala = 100 μm. (C) Questo schema illustra un dispositivo Gut-on-a-Chip costituito da una membrana porosa posta tra i microcanali superiore e inferiore. Il microcanale superiore è indicato dall'area blu, mentre il microcanale inferiore è indicato dall'area rossa. Su ciascun lato del microcanale sono presenti camere a vuoto, che deformano la membrana porosa per imitare il movimento peristaltico24. (D) Una configurazione di Gut-on-a-Chip canino include un Gut-on-a-Chip basato su PDMS assemblato con un tubo posizionato su un vetrino coprioggetto 2,24. Il tubo di bypass è fondamentale per evitare l'accumulo di pressione all'interno del microcanale durante la manipolazione (ad esempio, il collegamento alle siringhe). Le clip di legante vengono utilizzate per bloccare il tubo. I materiali sensibili al volume possono essere infusi attraverso i fori aperti dell'uscita superiore o inferiore. Il terreno di coltura organoide può essere infuso collegando le siringhe agli aghi con estremità smussata e il flusso attraverso l'ingresso superiore e inferiore. Abbreviazioni: IBD = malattia infiammatoria intestinale; PDMS = polidimetilsilossano. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Formazione di strutture simili a villi in IBD canine Gut-on-a-Chip. Le cellule epiteliali dissociate sono state seminate in un Gut-on-a-Chip rivestito di ECM. Una volta che le cellule dissociate sono state attaccate alla membrana PDMS, il flusso apicale è stato avviato per 3 giorni (D0-D3). Quando si forma un monostrato 2D confluente (D3), viene avviato un flusso basolaterale con allungamento frequente (Stretching, AP e BL Flow). Dopo 2-3 giorni di doppio flusso e allungamento della membrana, il monostrato 2D inizia a sviluppare la morfogenesi 3D e dopo 9 giorni di coltura si formano strutture simili a villi (morfogenesi 3D, D9-D12). Abbreviazioni: ECM = matrice extracellulare; PDMS = polidimetilsilossano; AP = apicale; BL = basolaterale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Semina di organoidi intestinali canini e morfogenesi 3D in un Gut-on-a-Chip. (A) Le fasi sperimentali per l'attivazione superficiale di una membrana porosa in un Gut-on-a-Chip basato su PDMS. L'utilizzo del trattamento UV/Ozono, PEI e trattamento GA in combinazione facilita la reticolazione delle ammine presenti nelle soluzioni ECM. Questo processo porta all'immobilizzazione stabile delle proteine ECM sulla membrana porosa. (B) Le immagini a contrasto di fase mostrano le morfologie delle cellule immediatamente dopo la semina (a sinistra) e 3-5 ore dopo la semina (a destra). La membrana porosa dopo 3 ore di semina mostra aree più sottili e più scure in cui le singole cellule si sono attaccate, evidenziando il processo di attaccamento. (C) Le immagini a contrasto di fase raffigurano la morfogenesi 3D dei monostrati intestinali all'interno di un sistema Gut-on-a-Chip. Questi monostrati sono stati derivati da cani affetti da IBD e queste cellule organoidi sono state coltivate per un periodo di 12 giorni in condizioni dinamiche, che hanno comportato il flusso di fluidi e movimenti di allungamento. Barre di scala = 50 μm (B,C). Abbreviazioni: IBD = malattia infiammatoria intestinale; ECM = matrice extracellulare; PDMS = polidimetilsilossano; PEI = polietilimmina; GA = glutaraldeide. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Valutazione dello sviluppo morfologico 3D in Gut-on-a-Chip canino derivato da pazienti. (A) Imaging a immunofluorescenza di un Gut-on-a-Chip IBD canino, che mostra una vista dall'alto verso il basso di un epitelio 3D completamente sviluppato dopo 12 giorni di coltura, che viene valutato da un microscopio a fluorescenza. La proteina della giunzione stretta (ZO-1) è visualizzata in giallo; la membrana del bordo del pennello (F-actina) appare in rosso; e i nuclei sono colorati con DAPI e appaiono blu. (B) Imaging a immunofluorescenza di un Gut-on-a-Chip IBD canino utilizzando un microscopio confocale con una lente a lunga distanza. Come mostrato nello schema, viene mostrata un'immagine fluorescente di una sezione trasversale di una struttura simile a un villo di un epitelio 3D completamente sviluppato dopo 12 giorni di coltura. Inoltre, l'impilamento Z mostra una vista laterale dell'epitelio 3D, che rivela la formazione di strutture simili a villoni. La membrana del bordo a spazzola (F-actina) appare in rosso e i nuclei sono colorati con DAPI e appaiono blu. (C) La funzione di barriera intestinale è stata valutata e misurata mediante TEER in Gut-on-a-Chips canini derivati da pazienti. Valori stabili di TEER sono stati raggiunti il giorno 5 di coltura su Gut-on-a-Chip. Le barre di errore esprimono il SEM delle misurazioni. Il valore di TEER è stato misurato tra due repliche biologiche con una replica tecnica. Barre di scala = 50 μm (A), 25 μm (B). Abbreviazioni: IBD = malattia infiammatoria intestinale; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo; TEER = resistenza elettrica transepiteliale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura supplementare S1: Caratterizzazione dell'anticorpo policlonale anti-ZO-1 in monostrati derivati da colonoidi canini e su dispositivi Gut-on-a-Chip. (A) Colorazione in immunofluorescenza di ZO-1 in giallo con F-actina in rosso e loro immagine di sovrapposizione. Barra della scala = 25 μm. (B) La visualizzazione in immunofluorescenza di ZO-1 in giallo in "Leaky Gut Chips" è stata condotta in varie condizioni, tra cui la stimolazione con batteri probiotici (LGG + citochine o VSL#3 + citochine) e controlli privi di germi senza stimolazione probiotica (citochine). Barra graduata = 50 μm. Questa figura è riprodotta da Min et al.23. Fare clic qui per scaricare il file.

Tabella supplementare S1: Sintesi delle informazioni sui donatori di tessuti. Una tabella riassuntiva dell'età, del sesso, della razza, della valutazione istopatologica e del punteggio dell'indice di attività IBD canina (CIBDAI) dei donatori. Il CIBDAI è un sistema di punteggio numerico utilizzato per dedurre la gravità clinica nell'IBD33 canina. Fare clic qui per scaricare il file.

Discussion

Questo studio segna la dimostrazione pionieristica della compatibilità degli organoidi intestinali canini con lo sviluppo di un modello Gut-on-a-Chip IBD canino. L'integrazione di organoidi intestinali e colture monostrato derivate da organoidi in un sistema microfluidico (i.e., sistema Gut-on-a-Chip) ha ulteriormente evoluto la tecnologia, consentendo la creazione di modelli intestinali in vitro che imitano da vicino le dinamiche fisiologiche e sono più rappresentativi delle condizioni biologiche. In particolare, poiché ci sono pochissime segnalazioni di colture Gut-on-a-Chip che utilizzano organoidi derivati da IBD negli esseri umani, l'attuale studio che utilizza Gut-on-a-Chip derivato da IBD canine può fornire approfondimenti principali nello studio delle IBD negli esseri umani.

Il successo dello sviluppo della morfogenesi 3D dell'epitelio intestinale canino su un Gut-on-a-Chip richiede un'attenta attenzione a diversi passaggi critici. In primo luogo, la superficie idrofobica dei canali microfluidici PDMS può impedire l'adesione dell'ECM e il successivo attacco cellulare, rendendo necessaria l'attivazione superficiale del PDMS prima del rivestimento dell'ECM e della semina cellulare (vedere la sezione 1 del protocollo). Per ottenere una coltura monostrato stabile, la rimozione delle cellule non attaccate in eccesso è fondamentale dopo l'attacco cellulare (fasi 4.6-4.7 del protocollo). Inoltre, la stimolazione dinamica, come il flusso medio costante e il movimento del vuoto simile a quello peristaltico, è necessaria per la morfogenesi 3D dell'epitelio intestinale (fase 5.2 del protocollo). Un'attenta manipolazione è essenziale per evitare bolle d'aria nel microcanale durante qualsiasi fase della coltura Gut-on-a-Chip.

Se si riscontra una scarsa semina delle cellule nel Gut-on-a-Chip, potrebbe essere dovuto a un basso numero di cellule o a uno scarso attaccamento delle cellule. Per risolvere il problema del basso numero di cellule, è importante ispezionare lo stato di salute degli organoidi intestinali preparati osservando la loro crescita in Matrigel. La vitalità cellulare può essere valutata mediante colorazione blu di tripano dopo la dissociazione cellulare per garantire che non più del 20% delle cellule sia morto. Se il numero di cellule vitali è insufficiente, si può tentare di ottimizzare le condizioni del terreno organoide. Un'altra possibilità è la dissociazione incompleta degli organoidi, con conseguente eccesso di grumi cellulari più grandi di 70 μm che rimangono intrappolati dal filtro. Per risolvere questo problema, un'opzione consiste nell'estendere la durata del pipettaggio durante la dissociazione cellulare. In alternativa, la provetta conica da 15 ml può essere agitata delicatamente ogni minuto durante il trattamento con una proteasi simile alla tripsina. Uno scarso attaccamento delle cellule al Gut-on-a-Chip può essere dovuto a un rivestimento ECM improprio. Durante il processo di rivestimento, si consiglia di verificare attentamente la presenza di bolle d'aria e prevenirne la formazione aggiungendo delicatamente altra soluzione di rivestimento secondo necessità. Il sovraffollamento delle celle e l'incapacità di lavare via le cellule non attaccate possono portare a un monostrato iniziale insufficiente. In tal caso, è possibile applicare una leggera pulsazione quando si spinge lo stantuffo della siringa. Questi passaggi per la risoluzione dei problemi possono aiutare a identificare e risolvere i problemi durante il processo di coltura Gut-on-a-Chip.

Sebbene questa piattaforma Gut-on-a-Chip consenta la creazione di strati epiteliali 3D ondulati, riconosciamo la necessità di un'ulteriore complessità biologica per replicare completamente il microambiente intestinale. È fondamentale considerare le interazioni tra cellule epiteliali e mesenchimali, la deposizione di ECM per la rigenerazione 3D e la presenza di caratteristiche di cripto-villi che stabiliscono una nicchia di cellule staminali adatta. Le cellule stromali, come i fibroblasti, svolgono un ruolo fondamentale nella produzione di proteine ECM e nella regolazione della morfogenesi intestinale34,35,36. L'inclusione di cellule mesenchimali in questo modello ha il potenziale per migliorare sia la morfogenesi che l'efficienza dell'attacco cellulare. Gli strati endoteliali, che comprendono la vascolarizzazione capillare e i vasi linfatici, svolgono un ruolo cruciale nel governare il trasporto molecolare e il reclutamento delle cellule immunitarie37,38. L'inclusione di cellule immunitarie derivate dal paziente potrebbe essere essenziale nella modellazione delle malattie intestinali in quanto consente di dimostrare l'interazione tra immunità innata e adattativa, nonché l'instaurazione di un'immunità tessuto-specifica39. Dopo il completamento della morfogenesi 3D su Gut-on-a-Chip, il terreno di coltura organoide può essere modificato in un terreno di differenziazione organoide. Questo può essere un approccio praticabile per indurre un'ulteriore differenziazione cellulare, a seconda degli obiettivi sperimentali.

L'imaging della microarchitettura 3D in situ è impegnativo a causa della lunga distanza di lavoro richiesta, che può essere superata con un obiettivo a lunga distanza. Inoltre, i metodi di microfabbricazione e incollaggio strato per strato rendono difficile l'accesso agli strati superiori per l'esame con SEM. Per l'attuale design Gut-on-a-Chip, è necessaria una pompa a siringa per microdispositivo Gut-on-a-Chip, occupando lo spazio dell'incubatore di CO2 e impedendo esperimenti su larga scala. Sono necessarie innovazioni per aumentare la scalabilità per una piattaforma user-friendly e uno screening ad alto rendimento.

Questi protocolli attuali consentono lo sviluppo spontaneo di strati epiteliali 3D in vitro, superando i limiti dei tradizionali organoidi 3D, dei monostrati 2D e dei sistemi di coltura statici di microdispositivi. Questo microambiente intestinale dinamico in vitro può essere controllato introducendo co-colture di diversi tipi cellulari. Studi precedenti hanno esplorato metodi per manipolare il microambiente Gut-on-a-Chip, tra cui la co-coltura del microbioma intestinale14,23 e delle cellule mononucleate periferiche30. Questo microambiente ricostituito ha numerose potenziali applicazioni, tra cui test farmacologici, studi meccanicistici fondamentali e modellazione delle malattie. Il microambiente ricostruito ha un potenziale significativo per un'ampia gamma di applicazioni, come i test antidroga 23,40,41 e la modellazione delle malattie 12,13,14,30, nonché indagini meccanicistiche fondamentali sulla morfogenesi intestinale 42. Una varietà di saggi può essere eseguita raccogliendo surnatanti per la valutazione dei metaboliti 43, raccogliendo cellule per l'esame genomico 2,32 o esaminando visivamente le cellule utilizzando coloranti per cellule vive o fissazione per la successiva imaging a immunofluorescenza 23,44.

Questo studio presenta un protocollo riproducibile per lo sviluppo della morfogenesi 3D degli strati epiteliali intestinali canini in una piattaforma Gut-on-a-Chip. La struttura epiteliale 3D risultante fornisce una rappresentazione più realistica del microambiente intestinale, che ha un immenso potenziale per le applicazioni in vari studi biomedici. Utilizzando questa architettura intestinale, possiamo condurre più ricerche traslazionali e potenzialmente produrre risultati promettenti.

Disclosures

Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi da dichiarare.

Acknowledgements

Vorremmo ringraziare il servizio di Medicina Interna per Piccoli Animali della WSU (Dr. Jillian Haines, Dr. Sarah Guess, Shelley Ensign LVT) e la coordinatrice degli studi clinici della WSU VTH Valorie Wiss per il loro supporto nel reclutamento dei casi e nella raccolta di campioni da parte di cittadini scienziati (donatori di pazienti). Questo lavoro è stato sostenuto in parte dall'Ufficio del Direttore, dal National Institutes Of Health (K01OD030515 e R21OD031903 to Y.M.A.) e dalla Società Giapponese per la Promozione della Scienza Overseas Challenge Program for Young Researchers (202280196 to I.N.). La Figura 1A e la Figura 3A sono state create con BioRender.com.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Organoid basal medium
Advanced DMEM/F12Gibco12634-010
GlutaMAXGibco35050-0612 mM, glutamine substitute
1 M HEPESVWR Life ScienceJ848-500ML10 mM
100x penicillin–streptomycinCorningMT30009CI1x
Organoids and organoid medium
A-83-01 PeproTech 9094360500 nM
B27 supplement Gibco17504-0441x
CHIR99021Reprocell04-0004-base2.5 µM
HEK293 cells engineered to secrete Noggin Baylor College of Medicine
Murine EGFPeproTech 315-09-1MG50 ng/mL
Murine Wnt-3aPeproTech 315-20-10UG100 ng/mL
N-Acetyl-L-cysteineSigmaA9165-25G1 mM
N2 MAX Media supplement Gibco17502-0481x 
NicotinamideSigmaN0636-100G10 mM
Noggin Conditioned MediumNANA10% vol/vol 
PrimocinInvivoGenant-pm-1100 µg/ml
R-spondin1 (Rspo1) cellsTrevigen3710-001-01Rspo1 cells
R-Spondin-1 Conditioned MediumNANA20% vol/vol 
SB202190Sigma-AldrichS7067-25MG 10 µM
Y-27632StemCellTechnologies7230810 µM
[Leu15 ]-Gastrin I human Sigma-AldrichG9145-.5MG10 nM
Reagents
4% Paraformaldehyde solutionFisher ScientificAAJ19943K2
Alexa Fluor 647 PhalloidinThermo Fisher ScientificA22287x250 dilution
Anti-Rabbit IgG H&L labeled with Alexa Fluor 555Abcamab150078x1,000 dilution
Anti-ZO-1 polyclonal antibodyThermo Fisher Scientific61-7300x50 dilution
Cell Recovery SolutionCorning354253
Collagen I, Rat Tail 3 mg/mLGibcoA10483-01
Diamidino-2-phenylindole (DAPI)Thermo Fisher Scientific62248x1,000 dilution
EMS Glutaraldehyde Aqueous 50%Electron Microscopy Sciences16320
Matrigel MatrixCorning356255
Poly(ethyleneimine) solutionSigma408700-250ML
TrypLE ExpressGibco12604-021
Materials and Equipment
24-well culture platesCorning3524
87V Industrial MultimeterFluke Corporation
CentrifugeEppendorf5910R
CO2 incubatorEppendorfC170i
DMi8 fluorescence microscopeLeica microsystemsDMi8
Dry ovenFisher Scientific15-103-0519
FlexCell FX-5000 Tension systemFlexcell International Corporation
Inverted phase-contrast microscopeLeica microsystemsDMi1
SP8-X inverted confocal microscopeLeica microsystemsSP8-X
Syringe pumpBraintree Scientificmodel no. BS-8000 120V
Syringe, 3 mL sterileBD Biosciences14-823-435
Syringes, 1 mL sterileBD Biosciences14-823-434
UV/ozone generatorJelight Companymodel no. 30
Software
LAS X imaging software Leica microsystems

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