Интеграция органоидов собачьего кишечника и микрофлюидной системы Gut-on-a-Chip предлагает актуальные трансляционные модели для лечения кишечных заболеваний человека. Представленные протоколы позволяют проводить 3D-морфогенез и динамическое моделирование кишечника in vitro , помогая в разработке эффективных методов лечения кишечных заболеваний у собак и людей с помощью концепции «Единое здоровье».
Кишечник собак имеет сходство в анатомии, микробиологии и физиологии с человеческим, и у собак естественным образом развиваются спонтанные кишечные расстройства, похожие на человеческие. Преодоление присущего трехмерным (3D) органоидам ограничения доступа к апикальной поверхности кишечного эпителия привело к созданию двумерных (2D) монослойных культур, которые обнажают доступную просветную поверхность с помощью клеток, полученных из органоидов. Интеграция этих органоидов и однослойных культур, полученных из органоидов, в микрофлюидную систему Gut-on-a-Chip еще больше усовершенствовала технологию, позволив разработать более физиологически значимые динамические модели кишечника in vitro .
В данном исследовании мы представляем протокол генерации 3D-морфогенеза эпителия кишечника собак с использованием образцов первичной кишечной ткани, полученных от собак, страдающих воспалительным заболеванием кишечника (ВЗК). Мы также излагаем протокол для создания и поддержания 2D-монослойных культур и систем кишечник-на-чипе с использованием клеток, полученных из 3D-органоидов кишечника. Протоколы, представленные в этом исследовании, служат основой для создания микрофлюидной системы Gut-on-a-Chip, специально разработанной для собак. Закладывая основу для этого инновационного подхода, мы стремимся расширить применение этих методов в биомедицинских и трансляционных исследованиях в соответствии с принципами инициативы «Единое здоровье». Используя этот подход, мы можем разработать более физиологически значимые динамические модели in vitro для изучения физиологии кишечника как у собак, так и у людей. Это имеет большое значение для биомедицинских и фармацевтических применений, поскольку может помочь в разработке более эффективных методов лечения кишечных заболеваний у обоих видов.
Морфогенез кишечного эпителия в значительной степени изучался на моделях лабораторных животных, которые являются дорогостоящими, трудоемкими и неточноотражают процессы развития человека. Кроме того, традиционные статические 2D-модели клеточных культур не способны имитировать сложную пространственную организацию 3D-эпителиальной архитектуры. В результате, существует необходимость в протоколе для индуцирования 3D-морфогенеза in vitro с использованием эпителиальных клеток кишечника из животных моделей, имеющих отношение к человеку, чтобы продвинуть наше понимание архитектуры эпителия кишечника.
У собак-компаньонов развилась анатомия кишечника и состав микробиома, которые удивительно похожи на людей из-за их общей среды обитания и рациона во время одомашнивания3. В дополнение к этому сходству, и люди, и собаки имеют различные хронические заболевания, которые, как считается, связаны со здоровьем кишечника. У собак, как и у людей, могут спонтанно развиваться хронические заболевания, такие как ожирение, когнитивная дисфункция, сахарный диабет, воспалительные заболевания кишечника (ВЗК) и колоректальная аденокарцинома 4,5,6,7,8,9,10. Несмотря на разработку и использование эпителиальных клеток человека и мышей в предыдущих исследованиях Gut-on-a-Chip 2,11,12,13,14, эпителий кишечника собак до сих пор не использовался. Наш новый подход, использующий органоидный эпителий кишечника собак в динамической системе культивирования с 3D-морфогенезом эпителия, имеет большое значение как для собачьей, так и для человеческой медицины.
Недавние достижения в области культивирования органоидов кишечника привели к созданию культуры органоидов кишечника собак15. Эта система культивирования включает культивирование стволовых клеток кишечника при определенном морфогенном кондиционировании, в результате чего получается 3D-модель с самообновляющимися свойствами, полученная из взрослых стволовых клеток16. Однако проведение транспортных анализов или кокультур микробиома хозяина создает трудности с этой 3D-моделью из-за закрытого характера просвета кишечника17. Чтобы решить эту проблему, исследователи создали 2D-монослой, полученный из кишечных органоидов, что позволило обнажить поверхность просвета18,19. Однако как 3D-органоиды, так и 2D-монослои поддерживаются в статических условиях, которые не совсем точно отражают биомеханику микроокружения кишечника in vivo. Сочетание технологии органоидов собак, полученных от пациентов, с 3D-морфогенезом in vitro открывает возможность для трансляционных исследований хронических мультифакториальных заболеваний. Такой подход позволяет исследователям разрабатывать более эффективные методы лечения, приносящие пользу как людям, так и собакам, а также продвигать трансляционные исследования в соответствии с инициативой «Единое здоровье», которая представляет собой совместный подход, признающий взаимосвязь здоровья человека, животных и окружающей среды. Она содействует междисциплинарному сотрудничеству для решения сложных проблем в области здравоохранения и достижения оптимальных результатов в отношении здоровья для всех. Понимая взаимозависимость между людьми, животными и экосистемами, инициатива направлена на смягчение рисков, связанных с возникающими инфекционными заболеваниями, деградацией окружающей среды и другими общими проблемами в области здравоохранения20,21,22.
В этом протоколе описаны комплексные методы культивирования эпителиальных клеток кишечника собак, полученных из органоидов пациентов, на микроустройстве Gut-on-a-Chip с пористой мембраной на основе полидиметилсилоксана (PDMS). Установление морфогенеза 3D-эпителия путем интеграции органоидов кишечника собак и технологии Gut-on-a-Chip позволяет нам изучать, как кишечник развивается и поддерживает свою клеточную организацию и нишу стволовых клеток. Эта платформа предоставляет ценную возможность исследовать влияние сообществ микробиома на здоровье кишечника и понять, как эти сообщества генерируют микробные метаболиты, которые вносят свой вклад в патофизиологию кишечника14,23. Эти достижения теперь могут быть распространены на образцы кишечника собак, предоставляя исследователям возможность изучить сложную взаимосвязь между микробиомом кишечника и физиологией хозяина. Это открывает возможности для получения ценной информации о механизмах, лежащих в основе патофизиологии кишечника, и понимания потенциальной роли микробных метаболитов в здоровье собак и человека, а также в различных заболеваниях. Протокол, используемый для собачьего кишечника на чипе, воспроизводим, что делает его подходящей экспериментальной моделью для сравнительной медицины, поскольку этот подход позволяет исследовать взаимодействие микробиома хозяина, патогенные инфекции и терапевтические эффекты на основе пробиотиков как у собак, так и у людей.
Исследование было одобрено и проведено в соответствии с Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Университета штата Вашингтон (ASAF# 6993). В этом протоколе мы использовали хорошо зарекомендовавшее себя микрофлюидное устройство Gut-on-a-Chip из PDMS, которое было изготовлено на собственном предприятии2 (рис. 1D). Подробные методы изготовления микроустройства Gut-on-a-Chip можно найти в предыдущих отчетах 2,24. Этот протокол демонстрирует уникальную интеграцию кишечных органоидов и микрофлюидной системы (рис. 2).
1. Поверхностная активация Gut-on-a-Chip из PDMS
2. Покрытие внеклеточного матрикса (ВКМ) и подготовка питательной среды для культивирования Gut-on-a-Chip
3. Подготовка органоидных клеток кишечника собак к посеву
ПРИМЕЧАНИЕ: Для создания модели Gut-on-a-Chip в этом протоколе использовались органоиды толстой кишки собак (называемые колоноидами), полученные от собак с ВЗК. Эти колоноиды были получены из трех-пяти небольших фрагментов биопсированной ткани толстой кишки в соответствии с ранее описанным методом15,18. Для достижения оптимальных результатов крайне важно использовать колоноиды собак, которые прошли как минимум три культуральных пассажа для создания стабильных органоидов, пригодных для применения in vitro. Рекомендуется культивировать колоноиды собак в течение не менее 3-4 дней, чтобы способствовать адекватной дифференцировке многолинейных клеток внутри органоидов, обеспечивая их функциональную зрелость и пригодность для последующих экспериментов в модели Gut-on-a-Chip. Максимальный предел пассажа для этой работы составляет менее 20, как указано в предыдущем исследовании, которое продемонстрировало неизмененный фенотип и кариотип на протяжении 20 последовательных пассажей25. Сигналы этих доноров представлены в Дополнительной таблице S1.
4. Засев и формирование 2D клеточного монослоя
5. Установление 3D морфогенеза у собак Gut-on-a-Chip
ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как сливающиеся монослои сформированы в Gut-on-a-Chip, был введен средний поток как верхнего, так и нижнего каналов и клеточного штамма, чтобы инициировать 3D-морфогенез в 2D-монослой, как показано на рисунке 2.
6. Характеристика собачьей кишки на чипе
7. Барьерная функция эпителия
Этот протокол надежно способствует спонтанному развитию 3D-морфогенеза кишечника в системе Gut-on-a-Chip. В этом подходе используются эпителиальные клетки кишечника собак, полученные из кишечных органоидов, полученных от собак, страдающих воспалительным заболеванием кишечника (ВЗК) (рис. 1B). Периодическая кластеризация 3D-морфогенеза эпителиальных клеток кишечника собак может наблюдаться по всему микроканалу после 6-9 дней среднего потока (рис. 3C). Эти морфологические изменения можно отслеживать с помощью фазово-контрастных методов. В этом исследовании мы использовали органоиды, полученные от двух собак с диагнозом ВЗК. Примечательно, что успешный 3D-морфогенез наблюдался в двух биологических репликациях, каждый из которых выполнялся с двумя техническими репликатами. Результаты этого исследования обеспечивают основу для будущих исследований с участием кишечных органоидов, полученных от других доноров собак. Эти результаты демонстрируют потенциальную применимость и воспроизводимость нашего экспериментального подхода, о котором ранее сообщалось на человеческих образцах. Эти результаты являются еще одним подтверждением того, что технология Gut-on-a-Chip применима к эпителиальным клеткам кишечника собак, как сообщалось ранее в исследованиях с использованием эпителиальных клеток кишечника человека2.
Этот протокол показал, что иммунофлуоресцентное окрашивание может быть использовано для оценки 3D-структуры органоидных монослоев, образовавших ворсинчатые структуры в микрофлюидных чипах, с помощью обычной флуоресцентной микроскопии (рис. 4 А,Б). Этот протокол может быть адаптирован для валидации дифференцированных и пространственно организованных клеточных фенотипов с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания. Визуализация 3D-морфогенеза в кишечнике-на-чипе дает прекрасную возможность исследовать реакцию хозяина при различных патологических взаимодействиях 14,23,31. В сочетании с эпителиальными клетками, полученными от доноров-пациентов, как это было описано ранее на людях, эта технология может быть использована для построения персонализированных моделей кишечных заболеваний13. Благодаря интеграции иммунофлуоресцентной визуализации с методами таргетной визуализации РНК, такими как флуоресцентная гибридизация in situ, можно визуально анализировать транскриптомы и протеомы хозяина в системе Gut-on-a-Chip.
Сохранение целостности кишечной мембраны жизненно важно для поддержания кишечного гомеостаза, и платформа Gut-on-a-Chip обеспечивает ценное преимущество, позволяя точно контролировать и количественно оценивать эту важнейшую функцию. Измерение TEER с помощью технологии Gut-on-a-Chip имеет ряд преимуществ. Например, в предыдущих исследованиях была проведена успешная оценка TEER при совместном культивировании клеток кишечника с непатогенными и пробиотическими бактериями32, а также в условиях дырявого кишечника23. Это позволяет исследователям изучать влияние различных состояний на барьерную функцию кишечника и определять потенциальные вмешательства для укрепления здоровья кишечника.
Рисунок 1: Создание системы Gut-on-a-Chip для собак с ВЗК, полученной от пациентов. (A) Интеграция кишечных органоидов пациента и платформы Gut-on-a-Chip. Эндоскопическая биопсия может быть выполнена для выделения клеток кишечных крипт для разработки специфических для доноров кишечных органоидов. Эпителиальные клетки могут быть диссоциированы на отдельные клетки из органоидов, затем высеяны в Gut-on-a-Chip на основе PDMS и культивированы в уникальном динамическом микроокружении. (Б) Репрезентативные изображения колоноидов собаки с ВЗК. Масштабная линейка = 100 мкм. (C) На этой схеме показано устройство Gut-on-a-Chip, состоящее из пористой мембраны, расположенной между верхним и нижним микроканалами. Верхний микроканал обозначен синей областью, а нижний — красной. С каждой стороны микроканала имеются вакуумные камеры, которые деформируют пористую мембрану, имитируя перистальтическое движение24. (D) Установка собачьего Gut-on-a-Chip включает в себя Gut-on-a-Chip на основе PDMS в сборе с трубкой, которая размещена на защитном листе 2,24. Байпасная трубка имеет решающее значение для предотвращения образования давления в микроканале во время работы (т. е. при подключении к шприцам). Зажимы для связующего используются для зажима трубки. Чувствительные к объему материалы могут вводиться через открытые отверстия верхнего или нижнего выпускного отверстия. Органоидную питательную среду можно инфузивировать, подсоединив шприцы к иглам с тупым концом и протекающим через верхний и нижний вход. Сокращения: ВЗК = воспалительное заболевание кишечника; ПДМС = полидиметилсилоксан. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Формирование ворсинчатых структур при ВЗК собак Gut-on-a-Chip. Диссоциированные эпителиальные клетки были высеяны в покрытую ECM систему Gut-on-a-Chip. После того, как диссоциированные клетки были прикреплены к мембране PDMS, в течение 3 дней инициировался апикальный поток (D0-D3). При образовании сливающегося 2D монослоя (D3) инициируется базолатеральный поток с частым растяжением (Stretching, AP и BL Flow). Через 2-3 суток двойного потока и растяжения мембраны 2D монослой начинает развивать 3D морфогенез, а ворсинчатые структуры образуются после 9 суток культивирования (3D морфогенез, D9-D12). Сокращения: ECM = внеклеточный матрикс; ПДМС = полидиметилсилоксан; AP = верхушечный; BL = базолатеральный. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Посев органоидов в кишечнике собак и 3D-морфогенез в кишечнике-на-чипе . (A) Экспериментальные этапы поверхностной активации пористой мембраны в Gut-on-a-Chip на основе PDMS. Использование УФ/озоновой обработки, обработки PEI и GA в сочетании облегчает сшивание аминов, присутствующих в растворах ECM. Этот процесс приводит к стабильной иммобилизации белков ECM на пористой мембране. (B) Фазово-контрастные изображения демонстрируют морфологию клеток сразу после посева (слева) и через 3-5 ч после посева (справа). Пористая мембрана через 3 часа после посева показывает более тонкие и темные участки, где прикрепились отдельные клетки, подчеркивая процесс прикрепления. (C) Фазово-контрастные изображения отображают 3D-морфогенез монослоев кишечника в системе Gut-on-a-Chip. Эти монослои были получены от собак, пораженных ВЗК, и эти органоидные клетки культивировались в течение 12 дней в динамических условиях, которые включали поток жидкости и растягивающие движения. Масштабные линейки = 50 мкм (B,C). Сокращения: ВЗК = воспалительное заболевание кишечника; ECM = внеклеточный матрикс; ПДМС = полидиметилсилоксан; ПЭИ = полиэтиленимин; GA = глутаровый альдегид. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Оценка 3D-морфологического развития у собак Gut-on-a-Chip . (A) Иммунофлуоресцентная визуализация кишечника на чипе у собак с ВЗК, демонстрирующая вид сверху вниз полностью развитого 3D-эпителия после 12 дней культивирования, который оценивается с помощью флуоресцентного микроскопа. Белок плотного соединения (ZO-1) визуализирован желтым цветом; кисточно-каймовая мембрана (F-актин) окрашена в красный цвет; а ядра окрашены DAPI и выглядят синими. (B) Иммунофлуоресцентная визуализация кишечника на чипе у собак с ВЗК с использованием конфокального микроскопа с линзой на большом расстоянии. Как показано на схеме, показано флуоресцентное изображение поперечного среза ворсинчатой структуры полностью развитого 3D эпителия через 12 суток культивирования. Кроме того, Z-укладка показывает вид 3D эпителия сбоку, на котором видно образование ворсинчатых структур. Кисточная мембрана (F-актин) окрашена в красный цвет, а ядра окрашены DAPI и выглядят синими. (C) Функция кишечного барьера была оценена и измерена с помощью TEER у собак Gut-on-a-Chips, полученных от пациентов. Стабильные значения TEER были достигнуты на 5-й день культивирования на Gut-on-a-Chip. Столбцы погрешности выражают РЭМ измерений. Значение TEER измерялось между двумя биологическими репликатами с одной технической репликацией. Масштабные линейки = 50 мкм (А), 25 мкм (В). Сокращения: ВЗК = воспалительное заболевание кишечника; DAPI = 4',6-диамидино-2-фенилиндол; TEER = трансэпителиальное электрическое сопротивление. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок S1: Характеристика поликлональных антител против ZO-1 в монослоях колоноидов собак и на устройствах Gut-on-a-Chip. (А) Иммунофлуоресцентное окрашивание ZO-1 в желтый цвет с F-актином в красном цвете и их наложение. Масштабная линейка = 25 мкм. (B) Иммунофлуоресцентная визуализация ZO-1 желтого цвета в «Дырявых кишечных чипсах» проводилась в различных условиях, включая стимуляцию пробиотическими бактериями (LGG + цитокины или VSL#3 + цитокины) и безмикробный контроль без пробиотической стимуляции (цитокины). Масштабная линейка = 50 мкм. Эта цифра воспроизведена из Min et al.23. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Дополнительная таблица S1: Сводная информация о донорах тканей. Сводная таблица по возрасту, полу, породе, гистопатологической оценке и индексу активности ВЗК у собак (CIBDAI). CIBDAI — это числовая система оценки, используемая для определения клинической тяжести ВЗК33 у собак. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Это исследование знаменует собой новаторскую демонстрацию совместимости органоидов кишечника собак с разработкой модели кишечника на чипе у собак. Интеграция кишечных органоидов и однослойных культур, полученных из органоидов, в микрофлюидную систему (т.е. систему Gut-on-a-Chip) еще больше развила технологию, позволив создавать модели кишечника in vitro , которые точно имитируют физиологическую динамику и являются более репрезентативными для биологических условий. В частности, поскольку существует очень мало сообщений о культуре Gut-on-a-Chip с использованием органоидов, полученных из ВЗК, у людей, текущее исследование с использованием Gut-on-a-Chip, полученного из ВЗК у собак, может дать ведущее представление об изучении ВЗК у людей.
Успешное развитие 3D-морфогенеза эпителия кишечника собак на Gut-on-a-Chip требует тщательного внимания к нескольким критическим этапам. Во-первых, гидрофобная поверхность микрофлюидных каналов PDMS может препятствовать адгезии ECM и последующему прикреплению клеток, что приводит к необходимости поверхностной активации PDMS перед нанесением покрытия ECM и посевом клеток (см. раздел протокола 1). Для достижения стабильной монослойной культуры крайне важно удаление избыточных неприкрепленных клеток после прикрепления клеток (этапы протокола 4.6-4.7). Кроме того, динамическая стимуляция, такая как постоянный поток среды и перистальтическое движение вакуума, необходима для 3D-морфогенеза кишечного эпителия (шаг протокола 5.2). Осторожное обращение необходимо для того, чтобы избежать образования пузырьков воздуха в микроканале на любых этапах культивирования Gut-on-a-Chip.
Если вы столкнулись с плохим посевом клеток в кишечник-на-чипе, это может быть связано с низким количеством клеток или плохим прикреплением клеток. Для устранения неполадок с низким количеством клеток важно проверить здоровье подготовленных кишечных органоидов, наблюдая за их ростом в Матригеле. Жизнеспособность клеток может быть оценена с помощью окрашивания трипановым синим после диссоциации клеток, чтобы убедиться, что не более 20% клеток мертвы. Если количество жизнеспособных клеток недостаточно, можно попытаться оптимизировать условия органоидной среды. Другой возможностью является неполная органоидная диссоциация, приводящая к избытку клеточных скоплений размером более 70 мкм, которые попадают в ловушку фильтра. Чтобы решить эту проблему, одним из вариантов является увеличение продолжительности пипетирования во время диссоциации клеток. В качестве альтернативы коническую пробирку объемом 15 мл можно осторожно встряхивать каждую минуту во время лечения трипсиноподобной протеазой. Плохое прикрепление клеток к Gut-on-a-Chip может быть связано с неправильным покрытием ECM. В процессе нанесения покрытия рекомендуется тщательно проверять наличие пузырьков воздуха и предотвращать их образование, осторожно добавляя больше раствора покрытия по мере необходимости. Переполненность клеток и неспособность смыть неприкрепленные клетки могут привести к недостаточному исходному монослою. В таком случае при нажатии на поршень шприца может быть применена слабая пульсация. Эти действия по устранению неполадок могут помочь выявить и устранить проблемы в процессе культивирования Gut-on-a-Chip.
Несмотря на то, что эта платформа Gut-on-a-Chip позволяет создавать волнообразные 3D-слои эпителия, мы признаем необходимость дополнительной биологической сложности для полной репликации микроокружения кишечника. Крайне важно учитывать взаимодействие между эпителиальными и мезенхимальными клетками, осаждение ECM для 3D-регенерации и наличие характеристик крипт-ворсинок, которые устанавливают подходящую нишу стволовых клеток. Стромальные клетки, такие как фибробласты, играют жизненно важную роль в производстве белков ECM и регуляции кишечного морфогенеза34,35,36. Включение мезенхимальных клеток в эту модель имеет потенциал для усиления как морфогенеза, так и эффективности прикрепления клеток. Эндотелиальные слои, которые охватывают капиллярную сосудистую сеть и лимфатические сосуды, играют решающую роль в управлении молекулярным транспортом и рекрутировании иммунных клеток37,38. Включение иммунных клеток, полученных от пациентов, может иметь важное значение при моделировании кишечных заболеваний, поскольку оно позволяет продемонстрировать взаимодействие между врожденным и адаптивным иммунитетом, а также установить тканеспецифический иммунитет39. После завершения 3D-морфогенеза на Gut-on-a-Chip питательная среда органоидов может быть модифицирована в среду дифференцировки органоидов. Это может быть жизнеспособным подходом для индуцирования дополнительной клеточной дифференцировки, в зависимости от целей эксперимента.
Визуализация 3D-микроархитектуры in situ является сложной задачей из-за большого рабочего расстояния, которое может быть преодолено с помощью объектива на большом расстоянии. Кроме того, послойные методы микроизготовления и склеивания затрудняют доступ к верхним слоям для исследования с помощью СЭМ. Для текущей конструкции Gut-on-a-Chip требуется один шприцевой насос на каждое микроустройство Gut-on-a-Chip, что занимает место в инкубатореCO2 и предотвращает крупномасштабные эксперименты. Инновации необходимы для повышения масштабируемости для удобной платформы и высокопроизводительного скрининга.
Эти современные протоколы позволяют спонтанно разрабатывать 3D-эпителиальные слои in vitro, преодолевая ограничения традиционных 3D-органоидов, 2D-монослоев и статических микроустройств культуральных систем. Эту динамику микроокружения кишечника in vitro можно контролировать, вводя кокультуру различных типов клеток. В предыдущих исследованиях изучались методы манипулирования микроокружением кишечника-на-чипе, включая совместное культивирование кишечного микробиома14,23 и периферических мононуклеарных клеток30. Эта восстановленная микросреда имеет множество потенциальных применений, включая тестирование лекарств, фундаментальные механистические исследования и моделирование заболеваний. Реконструированное микроокружение обладает значительным потенциалом для широкого спектра применений, таких как тестирование на наркотики 23,40,41 и моделирование заболеваний 12,13,14,30, а также фундаментальные механистические исследования морфогенеза кишечника 42. Различные анализы могут быть выполнены либо путем сбора надосадочной жидкости для оценки метаболитов 43, либо путем сбора клеток для геномного исследования 2,32, либо путем визуального обследования клеток с использованием красителей из живых клеток или фиксации для последующей иммунофлуоресцентной визуализации 23,44.
В данном исследовании представлен воспроизводимый протокол разработки 3D-морфогенеза эпителиальных слоев кишечника собак на платформе Gut-on-a-Chip. Полученная 3D-структура эпителия обеспечивает более реалистичное представление микроокружения кишечника, что имеет огромный потенциал для применения в различных биомедицинских исследованиях. Используя эту архитектуру кишечника, мы можем проводить больше трансляционных исследований и потенциально давать многообещающие результаты.
Мы хотели бы поблагодарить Службу внутренней медицины мелких домашних животных WSU (д-р Джиллиан Хейнс, д-р Сара Гесс, Шелли Энсайн LVT) и координатора клинических исследований WSU VTH Валори Висс за их поддержку в наборе случаев и сборе образцов у гражданских ученых (доноров-пациентов). Эта работа была частично поддержана канцелярией директора Национальных институтов здравоохранения (K01OD030515 и R21OD031903 для Y.M.A.) и Японским обществом содействия науке за рубежом (202280196 для молодых исследователей). Рисунки 1A и 3A были созданы с помощью BioRender.com.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Organoid basal medium | |||
Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 2 mM, glutamine substitute |
1 M HEPES | VWR Life Science | J848-500ML | 10 mM |
100x penicillin–streptomycin | Corning | MT30009CI | 1x |
Organoids and organoid medium | |||
A-83-01 | PeproTech | 9094360 | 500 nM |
B27 supplement | Gibco | 17504-044 | 1x |
CHIR99021 | Reprocell | 04-0004-base | 2.5 µM |
HEK293 cells engineered to secrete Noggin | Baylor College of Medicine | ||
Murine EGF | PeproTech | 315-09-1MG | 50 ng/mL |
Murine Wnt-3a | PeproTech | 315-20-10UG | 100 ng/mL |
N-Acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165-25G | 1 mM |
N2 MAX Media supplement | Gibco | 17502-048 | 1x |
Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | 10 mM |
Noggin Conditioned Medium | NA | NA | 10% vol/vol |
Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | 100 µg/ml |
R-spondin1 (Rspo1) cells | Trevigen | 3710-001-01 | Rspo1 cells |
R-Spondin-1 Conditioned Medium | NA | NA | 20% vol/vol |
SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067-25MG | 10 µM |
Y-27632 | StemCellTechnologies | 72308 | 10 µM |
[Leu15 ]-Gastrin I human | Sigma-Aldrich | G9145-.5MG | 10 nM |
Reagents | |||
4% Paraformaldehyde solution | Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
Alexa Fluor 647 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A22287 | x250 dilution |
Anti-Rabbit IgG H&L labeled with Alexa Fluor 555 | Abcam | ab150078 | x1,000 dilution |
Anti-ZO-1 polyclonal antibody | Thermo Fisher Scientific | 61-7300 | x50 dilution |
Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
Collagen I, Rat Tail 3 mg/mL | Gibco | A10483-01 | |
Diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | 62248 | x1,000 dilution |
EMS Glutaraldehyde Aqueous 50% | Electron Microscopy Sciences | 16320 | |
Matrigel Matrix | Corning | 356255 | |
Poly(ethyleneimine) solution | Sigma | 408700-250ML | |
TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | |
Materials and Equipment | |||
24-well culture plates | Corning | 3524 | |
87V Industrial Multimeter | Fluke Corporation | ||
Centrifuge | Eppendorf | 5910R | |
CO2 incubator | Eppendorf | C170i | |
DMi8 fluorescence microscope | Leica microsystems | DMi8 | |
Dry oven | Fisher Scientific | 15-103-0519 | |
FlexCell FX-5000 Tension system | Flexcell International Corporation | ||
Inverted phase-contrast microscope | Leica microsystems | DMi1 | |
SP8-X inverted confocal microscope | Leica microsystems | SP8-X | |
Syringe pump | Braintree Scientific | model no. BS-8000 120V | |
Syringe, 3 mL sterile | BD Biosciences | 14-823-435 | |
Syringes, 1 mL sterile | BD Biosciences | 14-823-434 | |
UV/ozone generator | Jelight Company | model no. 30 | |
Software | |||
LAS X imaging software | Leica microsystems |
Explore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved