בידוד, הרחבה חוץ גופית ואפיון תאי גזע מזנכימליים מרקמת שומן אפידידימלית של עכבר

Summary

רקמת השומן היא מקור מצוין לתאי גזע מזנכימליים. כאן, אנו מביאים את המיצוי, הטיפוח והאפיון שלב אחר שלב של תאי גזע שמקורם ברקמת שומן (ADSCs) מרקמת שומן אפידידימלית של עכברים שוויצרים.

Abstract

תאי גזע מזנכימליים (MSCs) נחקרו בהרחבה כגישה טיפולית חדשה, בעיקר כדי לעצור דלקת מחמירה בשל הפוטנציאל שלהם לווסת את התגובה החיסונית. MSCs הם תאים בעלי זכויות חיסון המסוגלים לשרוד במושתלים אלוגניים שאינם תואמים אימונולוגית בהתבסס על ביטוי נמוך של מולקולות מורכבות היסטותאימות עיקריות מסוג I (MHC) ובשימוש בטיפול תאי להשתלה אלוגנית. תאים אלה יכולים להיות מבודדים ממספר רקמות, כאשר הנפוץ ביותר הוא מח העצם ורקמות השומן. אנו מספקים פרוטוקול קל לבידוד, תרבית ואפיון MSCs מרקמת שומן אפידידימלית של עכברים. רקמת השומן האפידידימלית נכרתת בניתוח, מקוטעת פיזית ומתעכלת בתמיסת 0.15% קולגן מסוג II. לאחר מכן, תאי גזע ראשוניים שמקורם ברקמת שומן (ADSCs) מתורבתים ומורחבים במבחנה, והאפיון הפנוטיפי מתבצע על ידי ציטומטריית זרימה. אנו מספקים גם את השלבים להתמיין ADSCs לתאים אוסטאוגניים, אדיפוגניים וכונדרוגניים, ולאחר מכן אפיון פונקציונלי של כל שושלת תאים. הפרוטוקול המסופק כאן יכול לשמש לניסויים in vivo ו - ex vivo , וכחלופה, תאי גזע שמקורם בשומן יכולים לשמש ליצירת תאים אימורטליים דמויי MSCs.

Introduction

תאי גזע מזנכימליים (MSCs) הם תאים רב-פוטנציאליים בוגרים המתמיינים לתאים כגון אוסטאובלסט, כונדרובלסט ואדיפוציט ^1,2. תאים אלה שוכנים במספר איברים, ובגלל זה, הם יכולים להיות מופקים מרקמות בוגרות כגון מח עצם, שריר, שומן, זקיק שיער, שורש השן, שליה, דרמיס, פריכונדריה, חבל הטבור, ריאות, כבד, טחול ^3,4.

ההשפעות של MSCs על הפיזיולוגיה והמערכת החיסונית דווחו ^5,6. תאים אלה היו מבטיחים לטיפול במספר מחלות, הן ברפואה האנושית והן ברפואה הווטרינרית. MSCs יכולים ....

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים נערכו על פי הנחיות בינלאומיות לאתיקה של בעלי חיים ואושרו על ידי ועדות מוסדיות לטיפול ושימוש מאוניברסיטת המדינה של סנטה קרוז תחת פרוטוקול מספר 021/22. עכברים זכרים שוויצרים (6-8 שבועות) נרכשו מהמעבדה להרבעה, תחזוקה וניסויים בבעלי חיים - מתקן מחקר בעלי חיים של אוניברסיטת ס.......

Discussion

MSCs ניתן לחלץ רקמות שונות. למרות שמח עצם מייצג מקור משותף של MSCs הן במורין והן בבני אדם^25,26, בחרנו לעבוד עם רקמת השומן במחקר זה בגלל העושר שלה ב- MSCs, הפיזור בגוף וקלות הגישה אליה. כחלופה, ניתן להשתמש בתאי גזע שמקורם בשומן כדי ליצור תאים אימורטליים דמויי MSCs

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
140 °C High Heat Sterilization CO2 Incubator	RADOBIO SCIENTIFIC CO. LTD, China	C180
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	I7018
Acetic acid glacial	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	PHR1748
Alcian Blue 8GX	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	A9186	BioReagent, suitable for detection of glycoproteins. 1% in acetic acid, pH 2.5
Alcohol 70%	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	65350-M	70% in water
Amphotericin B	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	PHR1662
Antibodies anti-mouse anti-CD29 FITC (Clone Ha2/5)	BD Biosciences, San Diego, CA, USA	555005	Functions in the cell: Adhesion and activation, embryogenesis, Leukocytes, DC, platelets, mast cells, fibroblasts and endothelial cells
Antibodies anti-mouse anti-CD34 PE (Clone RAM34)	BD Biosciences, San Diego, CA, USA	551387	Functions in the cell: Cell adhesion factor. Hematopoietic stem cells
Antibodies anti-mouse anti-CD45 APC (Clone 30-F11)	BD Biosciences, San Diego, CA, USA	559864	Functions in the cell: Assists in the activation of leukocytes
Antibodies anti-mouse anti-CD71 FITC (Clone C2)	BD Biosciences, San Diego, CA, USA	553266	Functions in the cell: Controls iron uptake during cell proliferation. Proliferating cells, reticulocytes and precursors
Antibodies anti-mouse anti-CD90 PerCP (Clone OX-7)	BD Biosciences, San Diego, CA, USA	557266	Functions in the cell: Signaling, adhesion. T lymphocyte, NK, monocyte, HSC, neuron, fibroblast
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	PHR1008
Automatic pipettes	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	4700850N	Finnpipette F1 Good Laboratory Pipetting (GLP) Kits
Beaker	Not applicable		1 unit
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	A7906
Cell culture plates (6-well)	Merck, Darmstadt, Germany	Z707759	07 units sterile. TPP tissue culture plates
Cell culture plates (96-well. Round or V bottom)	Merck, Darmstadt, Germany	CLS353077	01 unit sterile. Wells, 96, Tissue Culture (TC)-treated surface, round bottom clear wells, sterile
Chondrogenic medium	Stem Pro Chondrogenesis Differentiation–Life Technologies	A1007101	TGF-β2, TGF-β3, dexamethasone, insulin, transferrin, ITS, sodium-l - ascorbate, sodium pyruvate, ascorbate-2-phosphate
Collagenase type II	Life Technologies, California, USA	17101015
cork or styrofoam board covered with aluminum	Not applicable		1 unit
cotton	Not applicable		50 g
Dexamethasone	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	D4902
Dissecting scissor	Not applicable		03 units sterile
DPX Mountant for histology	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	6522
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	D5523	With 1000 mg/L glucose and L-glutamine, without sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture
Eosin B	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	861006
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	F4135
Formaldehyde	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	47608
Formalin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	HT501128
Gentamicin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	G1397
Hematoxylin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	H3136
Hypodermic Needle (0.3mm x 13mm)	Not applicable		5 units
Indomethacin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	I0200000
Insulin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	I3536
Isopropanol	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	563935	70% in H2O
Ketamine-D4 hydrochloride solution	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	K-006	1.0 mg/mL in methanol (as free base), certified reference material, Cerilliant®
Neubauer chamber	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	BR718620	BRAND counting chamber BLAUBRAND Neubauer pattern. With clips, double ruled
Nichiryo pipette tips (0.1–10 μL)	Merck, Darmstadt, Germany	Z645540	Volume range 0.1–10 μL, elongated, bulk pack. Sterile
Nichiryo pipette tips (1–10 mL)	Merck, Darmstadt, Germany	Z717401	Volume range 1–10 mL, universal, bulk pack. Sterile
Nichiryo pipette tips (200 μL)	Merck, Darmstadt, Germany	Z645516	Maximum volume 200 μL, graduated, ministack. Sterile
Oil-Red O solution	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	O1391	0.5% in isopropanol
Paraffin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	107.151	46–48, in block form
Penicillin/Streptomycin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	P4333	Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, 0.1 μm filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Phosphate-buffered saline solution 1x (PBS).	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	P3813	Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions. Balanced and sterile
Polypropylene conical tubes (15 mL)	Falcon, Fisher Scientific	14-959-53A	Sterile
Polypropylene conical tubes (50 mL)	Falcon, Fisher Scientific	14-432-22	2 units sterile
scalpel (optional)	Not applicable		1 unit
Silver nitrate	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	85228
Sodium thiosulfate	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	72049
Surgical tweezer (15 cm)	Not applicable		3 units sterile
Swiss male mice (6–8 weeks)	Bioterium, Santa Cruz State University	021/22
syringe (1 mL)	Not applicable		1 unit
Trypan Blue Dye	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	T8154	0.4%, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
Trypsin/EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	T3924
Xylazine	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	PHR3263
β-glycerophosphate disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	G9422	BioUltra, suitable for cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99% (titration)