מיון חד-תאי של תאי גזע מזנכימליים אימונופנוטיפיים משיניים נשירות שעברו קילוף אנושי

Summary

פרוטוקול זה מתאר את השימוש במיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות של תאי גזע מזנכימליים אנושיים בשיטת המיון של תא יחיד. באופן ספציפי, השימוש במיון תא בודד יכול להשיג טוהר של 99% של התאים האימונופנוטיפיים מאוכלוסייה הטרוגנית בשילוב עם גישה מבוססת ציטומטריית זרימה מולטי-פרמטרית.

Abstract

תאי הגזע המזנכימליים (MSCs) של אורגניזם הם בעלי יכולת יוצאת דופן להתמיין לשושלות מרובות של תאים בוגרים בגוף וידועים בתכונותיהם האימונומודולטוריות והאנטי דלקתיות. השימוש בתאי גזע אלה הוא ברכה לתחום הביולוגיה הרגנרטיבית, אך בה בעת, פגע ברפואה רגנרטיבית ובטיפולים בשל העמימות התאית המרובים הקשורים אליהם. עמימות זו עשויה לנבוע מהמגוון במקור של תאי גזע אלה ומתנאי הגידול שלהם במבחנה , שניהם משקפים את ההטרוגניות התפקודית שלהם.

זה מצדיק מתודולוגיות לספק אוכלוסיות מטוהרות והומוגניות של MSCs ליישומים טיפוליים. ההתקדמות בתחום ציטומטריית הזרימה אפשרה זיהוי אוכלוסיות חד-תאיות בגישה רב-פרמטרית. פרוטוקול זה מתווה דרך לזהות ולטהר תאי גזע משיני נשירים אנושיים (SHEDs) באמצעות מיון חד-תאי בסיוע פלואורסצנטי. ביטוי סימולטני של סמנים על פני השטח, כלומר, CD90-fluorescein isothiocyanate (FITC), CD73-peridinin-chlorophyll-protein (PerCP-Cy5.5), CD105-allophycocyanin (APC), ו- CD44-V450, זיהה את הביטויים החיוביים "הבהירים" של MSCs באמצעות ציטומטריית זרימה רב-פרמטרית. עם זאת, נצפתה ירידה משמעותית באחוזים של מבטאים מרובעים של סמנים חיוביים אלה מקטע 7 ואילך לקטעים המאוחרים יותר.

תת-האוכלוסיות האימונופנוטיפיות מוינו באמצעות מצב מיון של תא בודד, שבו רק שני סמן חיובי וסמן שלילי אחד היוו את קריטריוני ההכללה. מתודולוגיה זו הבטיחה את יכולת הקיום של התאים של האוכלוסיות הממוינות ושמרה על התפשטות תאים לאחר המיון. היישום במורד הזרם עבור מיון כזה יכול לשמש להערכת הבחנה ספציפית לשושלת עבור תת-אוכלוסיות מגודרות. גישה זו יכולה להיות מיושמת במערכות חד-תאיות אחרות כדי לשפר את תנאי הבידוד ולהשיג מידע על סמנים מרובים של פני התא.

Introduction

תאי גזע מזנכימליים (MSCs) יכולים להיחשב כמקור מדרגי של תאים המתאימים לטיפולים מבוססי תאים ועשויים להיחשב למערכת תקן זהב ברפואה רגנרטיבית. תאים אלה יכולים להיות מבודדים ממגוון מקורות בגוף עם מקורות רקמה שונים¹. בהתאם לרקמת המקור שלהם, כל סוג של MSC מציג התנהגות חוץ גופית מעורפלת². זה נצפה היטב בתכונות המורפולוגיות והפונקציונליות שלהם³. מחקרים רבים הראו שונות תוך-שבטית במימדים, כולל התמיינות רקמות בוגרות, מצב גנומי וארכיטקטורה מטבולית ותאית של MSCs ^2,4.

אימונופנוטיפ של תאים היה יישום נפוץ של ציטומטריית זר....

Protocol

אישור אתיקה והסכמה להשתתף: דגימות מוך שיניים נשיר פילינג אנושי התקבלו לאחר קבלת הסכמה מדעת ואישור אתי מלא על ידי מכללת סרי רג'יב גנדי לרפואת שיניים ובית החולים (SRGCDS) מחלקת הפה והלסת בבנגלור, בהתאם לסטנדרטים שנקבעו על ידי הוועדה לאישור אתי של בית החולים, SRGCDS. לאחר מכן הבידוד, התרבית, התחזוקה ?.......

Discussion

בתחום הנדסת רקמות ורפואה רגנרטיבית, בין המקורות שלאחר הלידה, MSCs שמקורם ברקמת הפה משכו עניין רב בגלל מחויבויותיהם האתיות המינימליות ופוטנציאל התמיינות רב-שושלתי בולט²¹. תאי גזע של מוך השן (DPSCs) מהטוחנת השלישית שנפגעה זכו לתשומת הלב הרבה ביותר בקרב MSCs דנטליים בשל הפוטנציאל הטיפו.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alcian Blue Stain	HiMedia	CCK029-1KT
Antibiotic-Antimycotic (100x)	Gibco by ThermoFisher	15240062
BD CompBead Plus Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus (7.5 µm) Particles Set	BD Biosciences	560497
BD FACS Accudrop Beads	BD Biosciences	345249	Used to set up the Laser delay when the sort module opens.
BD FACS Aria Fusion Flow cytometer	BD Biosciences	---
BD FACS Diva 9.4	BD Biosciences	---
BD FACS Sheath Fluid	BD Biosciences	342003	Used as sheath fluid for both analysis and sorting experiments in the BD FACSAria Fusion
BD FACSDiva CS&T Research Beads	BD Biosciences	655050	Used for Instrument configuration depending on the nozzle size.
BD Horizon V450 Mouse Anti-Human CD44	BD Biosciences	561292
BD Horizon V450 Mouse IgG2b, κ Isotype Control	BD Biosciences	560374	CD44-V450 isotype
BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD105	BD Biosciences	562408
BD Pharmingen APC Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD Biosciences	555751	CD105-APC isotype
BD Pharmingen DAPI Solution	BD Biosciences	564907	DAPI Stock solution of 1 mg/mL
BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD90	BD Biosciences	555595
BD Pharmingen FITC Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD Biosciences	555748	CD90-FITC isotype
BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45	BD Biosciences	555483
BD Pharmingen PE Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD Biosciences	555749	CD45-PE isotype
BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mouse Anti-Human CD73	BD Biosciences	561260
BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD Biosciences	550795	CD73-PerCP-Cy 5.5 isotype
BD Pharmingen Purified Mouse Anti-Vimentin	BD Biosciences	550513
Bovine serum albumin	Hi-Media	TC548-5G
Crystal violet	Nice chemical pvt ltd	C33809
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma-aldrich	D5652-50L	dPBS used for culture work and maintenance.
Ethanol	---	---	Used for general sterlization.
Fetal Bovine Serum	Gibco by ThermoFisher	10270-106
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555	ThermoFisher Scientific	A-21422
KO-DMEM	Gibco by ThermoFisher	10829018	Basal medium for undifferentiated hESCs, used in the preparation of culture media
L-Glutamine 200mM (100x)	Gibco by ThermoFisher	25030-081
Methanol, for Molecular Biology	Hi-Media	MB113
Oil red O	HiMedia	CCK013-1KT
Paraformaldehyde	loba chemie	30525-89-4
Penicillin Streptomycin (100x)	Gibco by ThermoFisher	15140- 122
Phalloidin (ActinGreen 488 ReadyProbes reagent)	Invitrogen	R37110
Silver Nitrate	HiMedia	MB156-25G
Sodium Thiosulphate pentahydrate	Chemport	10102-17-7
Sphero Rainbow Fluorescent Particles, 3.0 - 3.4 µm	BD Biosciences	556291
Staining buffer	Prepared in MIRM	----	It was prepared using 2% FBS in PBS
StemPro Adipogenesis Differentiation Basal Media	Gibco by ThermoFisher	A10410-01	Basal media for Adipogenic media
StemPro Adipogenesis Supplement	Gibco by ThermoFisher	A10065-01	Induction media for Adipogenic media
StemPro Chondrogenesis Supplement	Gibco by ThermoFisher	A10064-01	Induction media for Chondrogenic media
StemPro Osteogenesis Supplement	Gibco by ThermoFisher	A10066-01	Induction media for Osteoogenic media
StemPro Osteogenesis/Chondrogenesis Differentiation Basal Media	Gibco by ThermoFisher	A10069-01	Basal media for both Ostegenic and Chondrogenic media
Triton-X-100	Hi-Media	MB031
Trypan Blue	Gibco by life technologies	15250-061
Trypsin - EDTA Solution 1x	Hi-media	TCL049
Tween-20	MERCK	9005-64-5