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Este protocolo descreve o uso da classificação de células mesenquimais humanas ativadas por fluorescência usando o método de triagem de célula única. Especificamente, o uso de triagem unicelular pode atingir 99% de pureza das células imunofenotipadas de uma população heterogênea quando combinado com uma abordagem multiparamétrica baseada em citometria de fluxo.
As células-tronco mesenquimais (CTMs) de um organismo possuem uma extraordinária capacidade de se diferenciar em múltiplas linhagens de células adultas no corpo e são conhecidas por suas propriedades imunomoduladoras e anti-inflamatórias. O uso dessas células-tronco é um benefício para o campo da biologia regenerativa, mas, ao mesmo tempo, uma desgraça para a medicina regenerativa e terapêutica devido às múltiplas ambiguidades celulares associadas a elas. Essas ambiguidades podem decorrer da diversidade na fonte dessas células-tronco e de suas condições de crescimento in vitro , que refletem em sua heterogeneidade funcional.
Isso justifica metodologias para fornecer populações purificadas e homogêneas de CTMs para aplicações terapêuticas. Avanços no campo da citometria de fluxo têm possibilitado a detecção de populações unicelulares utilizando uma abordagem multiparamétrica. Este protocolo descreve uma maneira de identificar e purificar células-tronco de dentes decíduos esfoliados humanos (SHEDs) por meio da classificação unicelular assistida por fluorescência. A expressão simultânea de marcadores de superfície, a saber, CD90-fluoresceína isotiocianato (FITC), CD73-peridinina-clorofila-proteína (PerCP-Cy5.5), CD105-aloficocianina (APC) e CD44-V450, identificou os "brilhantes", expressores positivos de CTMs usando citometria de fluxo multiparamétrica. No entanto, observou-se uma queda significativa nas porcentagens de quatro expressores desses marcadores positivos a partir da passagem 7 para as passagens posteriores.
As subpopulações imunofenotipadas foram classificadas pelo modo de classificação unicelular, onde apenas dois marcadores positivos e um negativo constituíram os critérios de inclusão. Esta metodologia garantiu a viabilidade celular das populações selecionadas e manteve a proliferação celular após a triagem. A aplicação a jusante para tal classificação pode ser usada para avaliar a diferenciação linhagem específica para as subpopulações fechadas. Esta abordagem pode ser aplicada a outros sistemas de célula única para melhorar as condições de isolamento e para adquirir informações de múltiplos marcadores de superfície celular.
As células-tronco mesenquimais (CTMs) podem ser consideradas uma fonte escalável de células adequadas para terapias baseadas em células e podem ser consideradas um sistema padrão-ouro na medicina regenerativa. Essas células podem ser isoladas de uma variedade de fontes no organismo com diferentes origens teciduais1. Dependendo do tecido fonte, cada tipo de CTM apresenta comportamento in vitro ambíguo2. Isso é bem observado em suas propriedades morfológicas efuncionais3. Múltiplos estudos têm demonstrado variação intraclonal nas dimensões, incluindo diferenciação tecidual do adulto, estado....
Aprovação ética e consentimento para participar: Amostras de polpa dentária decídua esfoliada humana foram recebidas após a obtenção de consentimento informado e aprovação ética completa pelo Departamento Oral e Maxilofacial do Sri Rajiv Gandhi Dental College and Hospital (SRGCDS), Bengaluru, de acordo com os padrões estabelecidos pelo Comitê de Liberação Ética Hospitalar, SRGCDS. Em seguida, o isolamento, o cultivo, a manutenção e a aplicação de SHEDs foram aprovados e em conformidade com as diretriz.......
Os SHEDs foram caracterizados com ensaios de imunofluorescência padrão mostrando a expressão de vimentina (vermelho, filamentos intermediários tipo III), filamentos de actina (Alexa fluor 488 Phalloidin Probes) e núcleos corados com DAPI (Figura 1A). Para estimar suas capacidades proliferativas e formadoras de colônias, ensaios padrão de crescimento celular de curta duração foram realizados. Um aumento de 14,3 vezes na taxa de proliferação do dia 2 para o dia 8 foi mostrado na
No campo da engenharia de tecidos e da medicina regenerativa, entre as fontes pós-natais, as CTMs derivadas de tecidos orais têm atraído profundo interesse devido às suas obrigações éticas mínimas e notável potencial de diferenciação de multilinhagens21. As células-tronco da polpa dentária (CTSAP) do terceiro molar impactado e dos SHEDs têm atraído a maior atenção entre as CTMs dentárias por seu potencial terapêutico em doenças neurodegenerativas e traum.......
Os autores declaram não haver conflito de interesses referente à publicação deste artigo.
Agradecemos ao Flow Cell Facility no Jawaharlal Nehru Centre for Advanced Scientific Research, Bengaluru, Índia, pelo uso da instalação central de citometria de fluxo. A criossecção da cultura de pellets de células diferenciadas foi realizada no Neuberg Anand Reference Laboratory, Bengaluru, Índia. Este trabalho foi apoiado pelo financiamento intramuros da UC da Manipal Academy of Higher Education (MAHE), Índia. A AG agradece o apoio da Bolsa Dr. T. M. A. Pai do MAHE.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Alcian Blue Stain | HiMedia | CCK029-1KT | |
Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco by ThermoFisher | 15240062 | |
BD CompBead Plus Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus (7.5 µm) Particles Set | BD Biosciences | 560497 | |
BD FACS Accudrop Beads | BD Biosciences | 345249 | Used to set up the Laser delay when the sort module opens. |
BD FACS Aria Fusion Flow cytometer | BD Biosciences | --- | |
BD FACS Diva 9.4 | BD Biosciences | --- | |
BD FACS Sheath Fluid | BD Biosciences | 342003 | Used as sheath fluid for both analysis and sorting experiments in the BD FACSAria Fusion |
BD FACSDiva CS&T Research Beads | BD Biosciences | 655050 | Used for Instrument configuration depending on the nozzle size. |
BD Horizon V450 Mouse Anti-Human CD44 | BD Biosciences | 561292 | |
BD Horizon V450 Mouse IgG2b, κ Isotype Control | BD Biosciences | 560374 | CD44-V450 isotype |
BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD105 | BD Biosciences | 562408 | |
BD Pharmingen APC Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555751 | CD105-APC isotype |
BD Pharmingen DAPI Solution | BD Biosciences | 564907 | DAPI Stock solution of 1 mg/mL |
BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD90 | BD Biosciences | 555595 | |
BD Pharmingen FITC Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555748 | CD90-FITC isotype |
BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45 | BD Biosciences | 555483 | |
BD Pharmingen PE Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 555749 | CD45-PE isotype |
BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mouse Anti-Human CD73 | BD Biosciences | 561260 | |
BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences | 550795 | CD73-PerCP-Cy 5.5 isotype |
BD Pharmingen Purified Mouse Anti-Vimentin | BD Biosciences | 550513 | |
Bovine serum albumin | Hi-Media | TC548-5G | |
Crystal violet | Nice chemical pvt ltd | C33809 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-aldrich | D5652-50L | dPBS used for culture work and maintenance. |
Ethanol | --- | --- | Used for general sterlization. |
Fetal Bovine Serum | Gibco by ThermoFisher | 10270-106 | |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | ThermoFisher Scientific | A-21422 | |
KO-DMEM | Gibco by ThermoFisher | 10829018 | Basal medium for undifferentiated hESCs, used in the preparation of culture media |
L-Glutamine 200mM (100x) | Gibco by ThermoFisher | 25030-081 | |
Methanol, for Molecular Biology | Hi-Media | MB113 | |
Oil red O | HiMedia | CCK013-1KT | |
Paraformaldehyde | loba chemie | 30525-89-4 | |
Penicillin Streptomycin (100x) | Gibco by ThermoFisher | 15140- 122 | |
Phalloidin (ActinGreen 488 ReadyProbes reagent) | Invitrogen | R37110 | |
Silver Nitrate | HiMedia | MB156-25G | |
Sodium Thiosulphate pentahydrate | Chemport | 10102-17-7 | |
Sphero Rainbow Fluorescent Particles, 3.0 - 3.4 µm | BD Biosciences | 556291 | |
Staining buffer | Prepared in MIRM | ---- | It was prepared using 2% FBS in PBS |
StemPro Adipogenesis Differentiation Basal Media | Gibco by ThermoFisher | A10410-01 | Basal media for Adipogenic media |
StemPro Adipogenesis Supplement | Gibco by ThermoFisher | A10065-01 | Induction media for Adipogenic media |
StemPro Chondrogenesis Supplement | Gibco by ThermoFisher | A10064-01 | Induction media for Chondrogenic media |
StemPro Osteogenesis Supplement | Gibco by ThermoFisher | A10066-01 | Induction media for Osteoogenic media |
StemPro Osteogenesis/Chondrogenesis Differentiation Basal Media | Gibco by ThermoFisher | A10069-01 | Basal media for both Ostegenic and Chondrogenic media |
Triton-X-100 | Hi-Media | MB031 | |
Trypan Blue | Gibco by life technologies | 15250-061 | |
Trypsin - EDTA Solution 1x | Hi-media | TCL049 | |
Tween-20 | MERCK | 9005-64-5 |
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