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  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Este protocolo descreve o uso da classificação de células mesenquimais humanas ativadas por fluorescência usando o método de triagem de célula única. Especificamente, o uso de triagem unicelular pode atingir 99% de pureza das células imunofenotipadas de uma população heterogênea quando combinado com uma abordagem multiparamétrica baseada em citometria de fluxo.

Abstract

As células-tronco mesenquimais (CTMs) de um organismo possuem uma extraordinária capacidade de se diferenciar em múltiplas linhagens de células adultas no corpo e são conhecidas por suas propriedades imunomoduladoras e anti-inflamatórias. O uso dessas células-tronco é um benefício para o campo da biologia regenerativa, mas, ao mesmo tempo, uma desgraça para a medicina regenerativa e terapêutica devido às múltiplas ambiguidades celulares associadas a elas. Essas ambiguidades podem decorrer da diversidade na fonte dessas células-tronco e de suas condições de crescimento in vitro , que refletem em sua heterogeneidade funcional.

Isso justifica metodologias para fornecer populações purificadas e homogêneas de CTMs para aplicações terapêuticas. Avanços no campo da citometria de fluxo têm possibilitado a detecção de populações unicelulares utilizando uma abordagem multiparamétrica. Este protocolo descreve uma maneira de identificar e purificar células-tronco de dentes decíduos esfoliados humanos (SHEDs) por meio da classificação unicelular assistida por fluorescência. A expressão simultânea de marcadores de superfície, a saber, CD90-fluoresceína isotiocianato (FITC), CD73-peridinina-clorofila-proteína (PerCP-Cy5.5), CD105-aloficocianina (APC) e CD44-V450, identificou os "brilhantes", expressores positivos de CTMs usando citometria de fluxo multiparamétrica. No entanto, observou-se uma queda significativa nas porcentagens de quatro expressores desses marcadores positivos a partir da passagem 7 para as passagens posteriores.

As subpopulações imunofenotipadas foram classificadas pelo modo de classificação unicelular, onde apenas dois marcadores positivos e um negativo constituíram os critérios de inclusão. Esta metodologia garantiu a viabilidade celular das populações selecionadas e manteve a proliferação celular após a triagem. A aplicação a jusante para tal classificação pode ser usada para avaliar a diferenciação linhagem específica para as subpopulações fechadas. Esta abordagem pode ser aplicada a outros sistemas de célula única para melhorar as condições de isolamento e para adquirir informações de múltiplos marcadores de superfície celular.

Introduction

As células-tronco mesenquimais (CTMs) podem ser consideradas uma fonte escalável de células adequadas para terapias baseadas em células e podem ser consideradas um sistema padrão-ouro na medicina regenerativa. Essas células podem ser isoladas de uma variedade de fontes no organismo com diferentes origens teciduais1. Dependendo do tecido fonte, cada tipo de CTM apresenta comportamento in vitro ambíguo2. Isso é bem observado em suas propriedades morfológicas efuncionais3. Múltiplos estudos têm demonstrado variação intraclonal nas dimensões, incluindo diferenciação tecidual do adulto, estado....

Protocol

Aprovação ética e consentimento para participar: Amostras de polpa dentária decídua esfoliada humana foram recebidas após a obtenção de consentimento informado e aprovação ética completa pelo Departamento Oral e Maxilofacial do Sri Rajiv Gandhi Dental College and Hospital (SRGCDS), Bengaluru, de acordo com os padrões estabelecidos pelo Comitê de Liberação Ética Hospitalar, SRGCDS. Em seguida, o isolamento, o cultivo, a manutenção e a aplicação de SHEDs foram aprovados e em conformidade com as diretriz.......

Representative Results

Os SHEDs foram caracterizados com ensaios de imunofluorescência padrão mostrando a expressão de vimentina (vermelho, filamentos intermediários tipo III), filamentos de actina (Alexa fluor 488 Phalloidin Probes) e núcleos corados com DAPI (Figura 1A). Para estimar suas capacidades proliferativas e formadoras de colônias, ensaios padrão de crescimento celular de curta duração foram realizados. Um aumento de 14,3 vezes na taxa de proliferação do dia 2 para o dia 8 foi mostrado na

Discussion

No campo da engenharia de tecidos e da medicina regenerativa, entre as fontes pós-natais, as CTMs derivadas de tecidos orais têm atraído profundo interesse devido às suas obrigações éticas mínimas e notável potencial de diferenciação de multilinhagens21. As células-tronco da polpa dentária (CTSAP) do terceiro molar impactado e dos SHEDs têm atraído a maior atenção entre as CTMs dentárias por seu potencial terapêutico em doenças neurodegenerativas e traum.......

Acknowledgements

Agradecemos ao Flow Cell Facility no Jawaharlal Nehru Centre for Advanced Scientific Research, Bengaluru, Índia, pelo uso da instalação central de citometria de fluxo. A criossecção da cultura de pellets de células diferenciadas foi realizada no Neuberg Anand Reference Laboratory, Bengaluru, Índia. Este trabalho foi apoiado pelo financiamento intramuros da UC da Manipal Academy of Higher Education (MAHE), Índia. A AG agradece o apoio da Bolsa Dr. T. M. A. Pai do MAHE.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Alcian Blue StainHiMediaCCK029-1KT
Antibiotic-Antimycotic (100x) Gibco by ThermoFisher15240062
BD CompBead Plus Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus (7.5 µm) Particles SetBD Biosciences560497
BD FACS Accudrop Beads BD Biosciences345249Used to set up the Laser delay when the sort module opens.
BD FACS Aria Fusion Flow cytometerBD Biosciences---
BD FACS Diva 9.4BD Biosciences---
BD FACS Sheath FluidBD Biosciences342003Used as sheath fluid for both analysis and sorting experiments in the BD FACSAria Fusion
BD FACSDiva CS&T Research BeadsBD Biosciences655050Used for Instrument configuration depending on the nozzle size.
BD Horizon V450 Mouse Anti-Human CD44BD Biosciences561292
BD Horizon V450 Mouse IgG2b, κ Isotype ControlBD Biosciences560374CD44-V450 isotype
BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD105BD Biosciences562408
BD Pharmingen APC Mouse IgG1, κ Isotype ControlBD Biosciences555751CD105-APC isotype
BD Pharmingen DAPI SolutionBD Biosciences564907DAPI Stock solution of 1 mg/mL
BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD90BD Biosciences555595
BD Pharmingen FITC Mouse IgG1, κ Isotype ControlBD Biosciences555748CD90-FITC isotype
BD Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD45BD Biosciences555483
BD Pharmingen PE Mouse IgG1, κ Isotype ControlBD Biosciences555749CD45-PE isotype
BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mouse Anti-Human CD73BD Biosciences561260
BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Mouse IgG1, κ Isotype ControlBD Biosciences550795CD73-PerCP-Cy 5.5 isotype
BD Pharmingen Purified Mouse Anti-VimentinBD Biosciences550513
Bovine serum albuminHi-Media TC548-5G
Crystal violetNice chemical pvt ltd C33809
Dulbecco's Phosphate Buffered SalineSigma-aldrich  D5652-50LdPBS used for culture work and maintenance. 
Ethanol ------Used for general sterlization.
Fetal Bovine Serum Gibco by ThermoFisher 10270-106
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555ThermoFisher Scientific A-21422
KO-DMEMGibco by ThermoFisher 10829018Basal medium for undifferentiated hESCs, used in the preparation of culture media
L-Glutamine 200mM (100x)Gibco by ThermoFisher25030-081
Methanol, for Molecular Biology Hi-Media MB113
Oil red OHiMedia CCK013-1KT
Paraformaldehyde loba chemie30525-89-4
Penicillin Streptomycin (100x)Gibco by ThermoFisher 15140- 122
Phalloidin (ActinGreen 488 ReadyProbes reagent)Invitrogen R37110
Silver NitrateHiMedia MB156-25G
Sodium Thiosulphate pentahydrateChemport10102-17-7
Sphero Rainbow Fluorescent Particles, 3.0 - 3.4 µmBD Biosciences556291
Staining buffer Prepared in MIRM ----It was prepared using 2% FBS in PBS 
StemPro Adipogenesis Differentiation Basal Media Gibco by ThermoFisher A10410-01Basal media for Adipogenic media
StemPro Adipogenesis SupplementGibco by ThermoFisher A10065-01Induction media for Adipogenic media
StemPro Chondrogenesis SupplementGibco by ThermoFisher A10064-01Induction media for Chondrogenic media
StemPro Osteogenesis SupplementGibco by ThermoFisher A10066-01Induction media for Osteoogenic media
StemPro Osteogenesis/Chondrogenesis Differentiation Basal Media Gibco by ThermoFisher A10069-01Basal media for both Ostegenic and Chondrogenic media
Triton-X-100Hi-Media MB031
Trypan Blue Gibco by life technologies 15250-061
Trypsin - EDTA Solution 1xHi-media TCL049
Tween-20 MERCK 9005-64-5

References

  1. Kobolak, J., Dinnyes, A., Memic, A., Khademhosseini, A., Mobasheri, A. Mesenchymal stem cells: Identification, phenotypic characterization, biological properties and potential for regenerative medicine through biomaterial micro-engineering of their niche. Methods. 99, 62-68 (2016).
  2. Wilson, A., Hodgson-Garms, ....

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