מיקרו-הזרקה של רטרו-וירוס רקומביננטי RCAS(A) לעדשת עוף עוברית

Summary

מאמר פרוטוקול זה מתאר את המתודולוגיה של מיקרו-הזרקה של רטרו-וירוס RCAS(A) בעדשת עוף עוברית ככלי לחקר תפקוד באתרו וביטוי חלבונים במהלך התפתחות העדשה.

Abstract

עוף עוברי (Gallus domesticus) הוא מודל חייתי מבוסס היטב לחקר התפתחות העדשה והפיזיולוגיה, בהתחשב במידת הדמיון הגבוהה שלה לעדשה האנושית. RCAS(A) הוא רטרו-וירוס עוף בעל יכולת שכפול המדביק תאים מתחלקים, המשמש ככלי רב עוצמה לחקר הביטוי באתרו ותפקודם של חלבונים מסוג בר וחלבונים מוטנטיים במהלך התפתחות העדשה על ידי מיקרו-הזרקה ללומן הריק של שלפוחית העדשה בשלבי התפתחות מוקדמים, ומגביל את פעולתו לתאי עדשה מתרבים סביב. בהשוואה לגישות אחרות, כגון מודלים טרנסגניים ותרביות ex vivo, השימוש ברטרו-וירוס עופות בעל יכולת שכפול RCAS(A) מספק מערכת יעילה, מהירה וניתנת להתאמה אישית לביטוי חלבונים אקסוגניים בעוברי אפרוחים. באופן ספציפי, העברת גנים ממוקדת יכולה להיות מוגבלת לתאי סיבי עדשה מתרבים ללא צורך במקדמים ספציפיים לרקמות. במאמר זה, נסקור בקצרה את השלבים הדרושים להכנת רטרו-וירוס רקומביננטי RCAS(A), נספק סקירה מפורטת ומקיפה של הליך המיקרו-הזרקה, ונספק תוצאות לדוגמה של הטכניקה.

Introduction

מטרת פרוטוקול זה היא לתאר את המתודולוגיה של מיקרו-הזרקה של עדשת עוף עוברית של RCAS(A) (סרקומה של עופות / רטרו-וירוס לויקוזיס A). העברה רטרו-ויראלית יעילה בעדשת עוף עוברית הוכחה ככלי מבטיח לחקר in vivo של המנגנון המולקולרי והמבנה-תפקוד של חלבוני עדשה בפיזיולוגיה רגילה של העדשה, בתנאים פתולוגיים ובהתפתחות. יתר על כן, מודל ניסיוני זה יכול לשמש לזיהוי מטרות טיפוליות וסינון תרופות למצבים כגון קטרקט מולד אנושי. בסך הכל, פרוטוקול זה נועד לפרוס את הצעדים הדרושים לפיתוח פלטפורמה להתאמה אישית לחקר חלבוני עדשה.

אפרוחים עובריים (Gallus domesticus), בשל הדמיון שלהם במבנה העדשה ובתפקודה עם העדשה האנושית, הם מודל חייתי מבוסס היטב לחקר הת....

Protocol

מחקר זה נערך בהתאם לחוק צער בעלי חיים ולתקנות צער בעלי חיים בהתאם לעקרונות המדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים במרכז למדעי הבריאות של אוניברסיטת טקסס בסן אנטוניו. לסקירה כללית של הפרוטוקול, ראו איור 1.......

Discussion

מודל ניסיוני זה מציע הזדמנות לבטא את העניין של החלבונים בעדשה השלמה, מה שמוביל לחקר הרלוונטיות התפקודית של חלבונים אלה במבנה העדשה ובתפקודה. מודל המיקרו-הזרקה של אפרוח עוברי מבוסס בחלקו על עבודתו של Fekete et. ^al.6 ופותח עוד יותר על ידי Jiang et. ^al.8 ושימש כאמצעי להחדרת פלסמ?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm Filter	Corning	431118	For removing cellular debris from media
35 mm x 10 mm Culture Dish	FisherScientific	50-202-030	For using during microinjection
Centrifuge	Fisherbrand	13-100-676	Spinning down solution
Constructs	GENEWIZ	-	For generation of constructs
Dissecting microscope	AmScope	SM-4TZ-144A	Visualization of lens for microinjection
DNA PCR primers	Integrated DNA Technologies	-	Generation of primers: Intracellular loop (IL)-deleted Cx50 (residues 1–97 and 149–400) as well as the Cla12NCO vector were obtained with the following pair of primers: sense, CTCCTGAGAACCTACATCCT; antisense, CACCGCATGCCCAAAGTACAC ILs of Cx43 (residues 98–150) and Cx46 (residues 98–166) were  obtained with the following pairs of primers: sense, TACGTGATGAGGAAAGAAGAG; antisense, TCCTCCACGCATCTTTACCTTG; sense, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCC AT ACGGATTC, respectively Cla12NCO-Cx43 construct template was obtained with the following pair of primers: sense, CTGCTTCGTACTTACATCATC; antisense, GAACAC GTGCGCCAGGTAC ILs of Cx50 (residues 98–148) or Cx46 (residues 98–166) were cloned by using Cla12NCO-Cx50 and Cla12NCO-Cx46 constructs as the templates with the following pair of primers: sense, CACCATGTCCGCATGGAGGAGA; antisense, GGTCCCC TC CAGGCGAAAC; sense, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCCATACGGATTC, respectively
Drummond Nanoject II Automatic Nanoliter Injector	Drummond Scientific	3-000-204	Microinjection Pipet
Dual Gooseneck Lights Microscope Illuminator	AmScope	LED-50WY	Lighting for visualization
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Invitrogen		For cell culture
Egg Holder	-	-	Homemade styrofoam rings with 2-inch diameter and one-half inch height
Egg Incubator	GQF Manufacturing Company Inc.	1502	For incubation of fertilized eggs
Fast Green	Fisher scientific	F99-10	For visualization of viral stock injection
Fertilized white leghorn chicken eggs	Texas A&M University	N/A	Animal model of choice for microinjection (https://posc.tamu.edu/fertile-egg-orders/)
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone Laboratories		For cell culture
Fluorescein-conjugated anti-mouse IgG	Jackson ImmunoResearch	115-095-003	For anti-FLAG  1:500
Forceps	FisherScientific	22-327379	For moving things around and isolation
Glass capillaries	Sutter Instruments	B100-75-10	Glass micropipette for microinjection (O.D. 1.0 mm, I.D. 0.75 mm, 10 cm length)
Lipofectamine	Invitrogen	L3000001	For transfection
Manual vertical micropipette puller	Sutter Instruments	P-30	To obtain glass micropipette of the correct size
Microcentrifuge Tubes	FisherScientific	02-682-004	Dissolving solution
Microscope	Keyence	BZ-X710	For imaging staining
Parafilm	FisherScientific	03-448-254	Placing solution
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen		For cell culture
Pico-Injector	Harvard Apparatus	PLI-100	For delivering small liquid volumes precisely through micropipettes by applying a regulated pressure for a digitally set period of time
rabbit anti-chick AQP0	Self generated	-	Jiang JX, White TW, Goodenough DA, Paul DL. Molecular cloning and functional characterization of chick lens fiber connexin 45.6. Mol Biol Cell. 1994 Mar;5(3):363-73. doi: 10.1091/mbc.5.3.363.
rabbit anti-FLAG antibody	Rockland Immunichemicals	600-401-383	For staining FLAG
Rhodamine-conjugated anti-rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch	111-295-003	For anti-AQP0  1:500
Sponge clamping pad	Sutter Instruments	BX10	For storage of glass micropipette