Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מאמר פרוטוקול זה מתאר את המתודולוגיה של מיקרו-הזרקה של רטרו-וירוס RCAS(A) בעדשת עוף עוברית ככלי לחקר תפקוד באתרו וביטוי חלבונים במהלך התפתחות העדשה.

Abstract

עוף עוברי (Gallus domesticus) הוא מודל חייתי מבוסס היטב לחקר התפתחות העדשה והפיזיולוגיה, בהתחשב במידת הדמיון הגבוהה שלה לעדשה האנושית. RCAS(A) הוא רטרו-וירוס עוף בעל יכולת שכפול המדביק תאים מתחלקים, המשמש ככלי רב עוצמה לחקר הביטוי באתרו ותפקודם של חלבונים מסוג בר וחלבונים מוטנטיים במהלך התפתחות העדשה על ידי מיקרו-הזרקה ללומן הריק של שלפוחית העדשה בשלבי התפתחות מוקדמים, ומגביל את פעולתו לתאי עדשה מתרבים סביב. בהשוואה לגישות אחרות, כגון מודלים טרנסגניים ותרביות ex vivo, השימוש ברטרו-וירוס עופות בעל יכולת שכפול RCAS(A) מספק מערכת יעילה, מהירה וניתנת להתאמה אישית לביטוי חלבונים אקסוגניים בעוברי אפרוחים. באופן ספציפי, העברת גנים ממוקדת יכולה להיות מוגבלת לתאי סיבי עדשה מתרבים ללא צורך במקדמים ספציפיים לרקמות. במאמר זה, נסקור בקצרה את השלבים הדרושים להכנת רטרו-וירוס רקומביננטי RCAS(A), נספק סקירה מפורטת ומקיפה של הליך המיקרו-הזרקה, ונספק תוצאות לדוגמה של הטכניקה.

Introduction

מטרת פרוטוקול זה היא לתאר את המתודולוגיה של מיקרו-הזרקה של עדשת עוף עוברית של RCAS(A) (סרקומה של עופות / רטרו-וירוס לויקוזיס A). העברה רטרו-ויראלית יעילה בעדשת עוף עוברית הוכחה ככלי מבטיח לחקר in vivo של המנגנון המולקולרי והמבנה-תפקוד של חלבוני עדשה בפיזיולוגיה רגילה של העדשה, בתנאים פתולוגיים ובהתפתחות. יתר על כן, מודל ניסיוני זה יכול לשמש לזיהוי מטרות טיפוליות וסינון תרופות למצבים כגון קטרקט מולד אנושי. בסך הכל, פרוטוקול זה נועד לפרוס את הצעדים הדרושים לפיתוח פלטפורמה להתאמה אישית לחקר חלבוני עדשה.

אפרוחים עובריים (Gallus domesticus), בשל הדמיון שלהם במבנה העדשה ובתפקודה עם העדשה האנושית, הם מודל חייתי מבוסס היטב לחקר הת....

Protocol

מחקר זה נערך בהתאם לחוק צער בעלי חיים ולתקנות צער בעלי חיים בהתאם לעקרונות המדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים במרכז למדעי הבריאות של אוניברסיטת טקסס בסן אנטוניו. לסקירה כללית של הפרוטוקול, ראו איור 1.......

Representative Results

לאחר קביעת חלבון מטרה ספציפי וזיהוי רצפי הגנים הקשורים, הגישה הניסויית הכוללת כוללת שיבוט של רצפי הגן לווקטור RCAS(A) רטרו-ויראלי על ידי השיבוט הראשוני לווקטור מתאם, ואחריו וקטור נגיפי. שנית, חלקיקים נגיפיים בעלי טיטר גבוה מוכנים באמצעות תאי אריזה כדי לקצור ולרכז את הנגיפים. שני הצעדים העיקר?.......

Discussion

מודל ניסיוני זה מציע הזדמנות לבטא את העניין של החלבונים בעדשה השלמה, מה שמוביל לחקר הרלוונטיות התפקודית של חלבונים אלה במבנה העדשה ובתפקודה. מודל המיקרו-הזרקה של אפרוח עוברי מבוסס בחלקו על עבודתו של Fekete et. al.6 ופותח עוד יותר על ידי Jiang et. al.8 ושימש כאמצעי להחדרת פלסמ?.......

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH): RO1 EY012085 (ל- J.X.J) ו- F32DK134051 (ל- F.M.A), ומענק קרן וולש: AQ-1507 (ל- J.X.J). התוכן הוא באחריותם הבלעדית של המחברים ואינו מייצג בהכרח את הדעות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות. הדמויות נוצרו חלקית עם Biorender.com.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 µm FilterCorning431118For removing cellular debris from media
35 mm x 10 mm Culture DishFisherScientific50-202-030For using during microinjection
CentrifugeFisherbrand13-100-676Spinning down solution
ConstructsGENEWIZ-For generation of constructs
Dissecting microscopeAmScopeSM-4TZ-144AVisualization of lens for microinjection
DNA PCR primersIntegrated DNA Technologies-Generation of primers:

Intracellular loop (IL)-deleted Cx50 (residues 1–97 and 149–400) as well as the Cla12NCO vector were obtained with the following pair of primers: sense, CTCCTGAGAACCTACATCCT; antisense, CACCGCATGCCCAAAGTACAC

ILs of Cx43 (residues 98–150) and Cx46 (residues 98–166) were  obtained with the following pairs of primers: sense, TACGTGATGAGGAAAGAAGAG; antisense, TCCTCCACGCATCTTTACCTTG; sense, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCC AT ACGGATTC, respectively

Cla12NCO-Cx43 construct template was obtained with the following pair of primers: sense, CTGCTTCGTACTTACATCATC; antisense, GAACAC GTGCGCCAGGTAC

ILs of Cx50 (residues 98–148) or Cx46 (residues 98–166) were cloned by using Cla12NCO-Cx50 and Cla12NCO-Cx46 constructs as the templates with the following pair of primers: sense, CACCATGTCCGCATGGAGGAGA; antisense, GGTCCCC TC CAGGCGAAAC; sense, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCCATACGGATTC, respectively
Drummond Nanoject II Automatic Nanoliter InjectorDrummond Scientific3-000-204Microinjection Pipet
Dual Gooseneck Lights Microscope IlluminatorAmScopeLED-50WYLighting for visualization
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)InvitrogenFor cell culture
Egg Holder--Homemade styrofoam rings with 2-inch diameter and one-half inch height
Egg IncubatorGQF Manufacturing Company Inc.1502For incubation of fertilized eggs
Fast GreenFisher scientificF99-10For visualization of viral stock injection
Fertilized white leghorn chicken eggsTexas A&M UniversityN/AAnimal model of choice for microinjection (https://posc.tamu.edu/fertile-egg-orders/)
Fetal Bovine Serum (FBS)Hyclone LaboratoriesFor cell culture
Fluorescein-conjugated anti-mouse IgGJackson ImmunoResearch115-095-003For anti-FLAG  1:500
ForcepsFisherScientific22-327379For moving things around and isolation
Glass capillariesSutter InstrumentsB100-75-10Glass micropipette for microinjection (O.D. 1.0 mm, I.D. 0.75 mm, 10 cm length)
LipofectamineInvitrogenL3000001For transfection
Manual vertical micropipette pullerSutter InstrumentsP-30To obtain glass micropipette of the correct size
Microcentrifuge TubesFisherScientific02-682-004Dissolving solution
MicroscopeKeyenceBZ-X710For imaging staining
ParafilmFisherScientific03-448-254Placing solution
Penicillin/StreptomycinInvitrogenFor cell culture
Pico-InjectorHarvard ApparatusPLI-100For delivering small liquid volumes precisely through micropipettes by applying a regulated pressure for a digitally set period of time
rabbit anti-chick AQP0Self generated-Jiang JX, White TW, Goodenough DA, Paul DL. Molecular cloning and functional characterization of chick lens fiber connexin 45.6. Mol Biol Cell. 1994 Mar;5(3):363-73. doi: 10.1091/mbc.5.3.363.
rabbit anti-FLAG antibodyRockland Immunichemicals600-401-383For staining FLAG
Rhodamine-conjugated anti-rabbit IgG Jackson ImmunoResearch111-295-003For anti-AQP0  1:500
Sponge clamping padSutter InstrumentsBX10For storage of glass micropipette

References

  1. Li, Z., Gu, S., Quan, Y., Varadaraj, K., Jiang, J. X. Development of a potent embryonic chick lens model for studying congenital cataracts in vivo. Communications Biology. 4 (1), 325 (2021).
  2. Chen, Y., et al.

Explore More Articles

RCAS AEx Vivo

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved