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Questo documento di protocollo descrive la metodologia della microiniezione embrionale di lenti di pollo di un retrovirus RCAS(A) come strumento per studiare la funzione in situ e l'espressione delle proteine durante lo sviluppo della lente.
Il pollo embrionale (Gallus domesticus) è un modello animale ben consolidato per lo studio dello sviluppo e della fisiologia del cristallino, dato il suo alto grado di somiglianza con il cristallino umano. RCAS(A) è un retrovirus di pollo competente per la replicazione che infetta le cellule in divisione, che funge da potente strumento per studiare l'espressione e la funzione in situ di proteine wild-type e mutanti durante lo sviluppo del cristallino mediante microiniezione nel lume vuoto della vescicola del cristallino nelle prime fasi di sviluppo, limitando la sua azione alle cellule del cristallino proliferanti circostanti. Rispetto ad altri approcci, come i modelli transgenici e le colture ex vivo , l'uso di un retrovirus aviario RCAS(A) competente per la replicazione fornisce un sistema altamente efficace, rapido e personalizzabile per esprimere proteine esogene negli embrioni di pulcino. In particolare, il trasferimento genico mirato può essere confinato alle cellule proliferative della fibra del cristallino senza la necessità di promotori tessuto-specifici. In questo articolo, forniremo una breve panoramica dei passaggi necessari per la preparazione del retrovirus ricombinante RCAS(A), forniremo una panoramica dettagliata e completa della procedura di microiniezione e forniremo i risultati di esempio della tecnica.
L'obiettivo di questo protocollo è quello di descrivere la metodologia di microiniezione embrionale di lenti di pollo di un RCAS(A) (sarcoma/leucosi retrovirale A competente per la replicazione). È stato dimostrato che l'efficace somministrazione retrovirale in una lente embrionale di pollo è uno strumento promettente per lo studio in vivo del meccanismo molecolare e della struttura-funzione delle proteine della lente nella normale fisiologia del cristallino, nelle condizioni patologiche e nello sviluppo. Inoltre, questo modello sperimentale potrebbe essere utilizzato per l'identificazione di bersagli terapeutici e lo screening farmacologico per condizioni co....
Questo studio è stato condotto in conformità con la legge sul benessere degli animali e i regolamenti di attuazione sul benessere degli animali in conformità con i principi della Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee presso l'Università del Texas Health Science Center di San Antonio. Per una panoramica del protocollo, vedere la Figura 1; vedere la Tabella dei
Dopo la determinazione di una specifica proteina bersaglio e l'identificazione della sequenza genica associata, l'approccio sperimentale complessivo prevede il clonaggio della sequenza genica in un vettore retrovirale RCAS(A) mediante il clonaggio iniziale in un vettore adattatore, seguito da un vettore virale. In secondo luogo, le particelle virali ad alto titolo vengono preparate utilizzando cellule di imballaggio per raccogliere e concentrare i virioni. Questi primi due passi principali sono stati ampiamente descritti.......
Questo modello sperimentale offre l'opportunità di esprimere la/e proteina/e di interesse nel cristallino intatto, portando allo studio della rilevanza funzionale di queste proteine nella struttura e nella funzione del cristallino. Il modello di microiniezione del pulcino embrionale si basa in parte sul lavoro di Fekete et. al.6 ed è stato ulteriormente sviluppato da Jiang et. al.8 ed è stato utilizzato come mezzo per inserire sia plasmidi virali che agenti come agonisti.......
Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni del National Institutes of Health (NIH): RO1 EY012085 (a J.X.J) e F32DK134051 (a FMA) e dalla sovvenzione della Welch Foundation: AQ-1507 (a J.X.J.). Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health. Le figure sono state parzialmente create con Biorender.com.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.22 µm Filter | Corning | 431118 | For removing cellular debris from media |
35 mm x 10 mm Culture Dish | FisherScientific | 50-202-030 | For using during microinjection |
Centrifuge | Fisherbrand | 13-100-676 | Spinning down solution |
Constructs | GENEWIZ | - | For generation of constructs |
Dissecting microscope | AmScope | SM-4TZ-144A | Visualization of lens for microinjection |
DNA PCR primers | Integrated DNA Technologies | - | Generation of primers: Intracellular loop (IL)-deleted Cx50 (residues 1–97 and 149–400) as well as the Cla12NCO vector were obtained with the following pair of primers: sense, CTCCTGAGAACCTACATCCT; antisense, CACCGCATGCCCAAAGTACAC ILs of Cx43 (residues 98–150) and Cx46 (residues 98–166) were obtained with the following pairs of primers: sense, TACGTGATGAGGAAAGAAGAG; antisense, TCCTCCACGCATCTTTACCTTG; sense, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCC AT ACGGATTC, respectively Cla12NCO-Cx43 construct template was obtained with the following pair of primers: sense, CTGCTTCGTACTTACATCATC; antisense, GAACAC GTGCGCCAGGTAC ILs of Cx50 (residues 98–148) or Cx46 (residues 98–166) were cloned by using Cla12NCO-Cx50 and Cla12NCO-Cx46 constructs as the templates with the following pair of primers: sense, CACCATGTCCGCATGGAGGAGA; antisense, GGTCCCC TC CAGGCGAAAC; sense, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCCATACGGATTC, respectively |
Drummond Nanoject II Automatic Nanoliter Injector | Drummond Scientific | 3-000-204 | Microinjection Pipet |
Dual Gooseneck Lights Microscope Illuminator | AmScope | LED-50WY | Lighting for visualization |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | For cell culture | |
Egg Holder | - | - | Homemade styrofoam rings with 2-inch diameter and one-half inch height |
Egg Incubator | GQF Manufacturing Company Inc. | 1502 | For incubation of fertilized eggs |
Fast Green | Fisher scientific | F99-10 | For visualization of viral stock injection |
Fertilized white leghorn chicken eggs | Texas A&M University | N/A | Animal model of choice for microinjection (https://posc.tamu.edu/fertile-egg-orders/) |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone Laboratories | For cell culture | |
Fluorescein-conjugated anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-095-003 | For anti-FLAG 1:500 |
Forceps | FisherScientific | 22-327379 | For moving things around and isolation |
Glass capillaries | Sutter Instruments | B100-75-10 | Glass micropipette for microinjection (O.D. 1.0 mm, I.D. 0.75 mm, 10 cm length) |
Lipofectamine | Invitrogen | L3000001 | For transfection |
Manual vertical micropipette puller | Sutter Instruments | P-30 | To obtain glass micropipette of the correct size |
Microcentrifuge Tubes | FisherScientific | 02-682-004 | Dissolving solution |
Microscope | Keyence | BZ-X710 | For imaging staining |
Parafilm | FisherScientific | 03-448-254 | Placing solution |
Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | For cell culture | |
Pico-Injector | Harvard Apparatus | PLI-100 | For delivering small liquid volumes precisely through micropipettes by applying a regulated pressure for a digitally set period of time |
rabbit anti-chick AQP0 | Self generated | - | Jiang JX, White TW, Goodenough DA, Paul DL. Molecular cloning and functional characterization of chick lens fiber connexin 45.6. Mol Biol Cell. 1994 Mar;5(3):363-73. doi: 10.1091/mbc.5.3.363. |
rabbit anti-FLAG antibody | Rockland Immunichemicals | 600-401-383 | For staining FLAG |
Rhodamine-conjugated anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-295-003 | For anti-AQP0 1:500 |
Sponge clamping pad | Sutter Instruments | BX10 | For storage of glass micropipette |
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