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  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Questo documento di protocollo descrive la metodologia della microiniezione embrionale di lenti di pollo di un retrovirus RCAS(A) come strumento per studiare la funzione in situ e l'espressione delle proteine durante lo sviluppo della lente.

Abstract

Il pollo embrionale (Gallus domesticus) è un modello animale ben consolidato per lo studio dello sviluppo e della fisiologia del cristallino, dato il suo alto grado di somiglianza con il cristallino umano. RCAS(A) è un retrovirus di pollo competente per la replicazione che infetta le cellule in divisione, che funge da potente strumento per studiare l'espressione e la funzione in situ di proteine wild-type e mutanti durante lo sviluppo del cristallino mediante microiniezione nel lume vuoto della vescicola del cristallino nelle prime fasi di sviluppo, limitando la sua azione alle cellule del cristallino proliferanti circostanti. Rispetto ad altri approcci, come i modelli transgenici e le colture ex vivo , l'uso di un retrovirus aviario RCAS(A) competente per la replicazione fornisce un sistema altamente efficace, rapido e personalizzabile per esprimere proteine esogene negli embrioni di pulcino. In particolare, il trasferimento genico mirato può essere confinato alle cellule proliferative della fibra del cristallino senza la necessità di promotori tessuto-specifici. In questo articolo, forniremo una breve panoramica dei passaggi necessari per la preparazione del retrovirus ricombinante RCAS(A), forniremo una panoramica dettagliata e completa della procedura di microiniezione e forniremo i risultati di esempio della tecnica.

Introduction

L'obiettivo di questo protocollo è quello di descrivere la metodologia di microiniezione embrionale di lenti di pollo di un RCAS(A) (sarcoma/leucosi retrovirale A competente per la replicazione). È stato dimostrato che l'efficace somministrazione retrovirale in una lente embrionale di pollo è uno strumento promettente per lo studio in vivo del meccanismo molecolare e della struttura-funzione delle proteine della lente nella normale fisiologia del cristallino, nelle condizioni patologiche e nello sviluppo. Inoltre, questo modello sperimentale potrebbe essere utilizzato per l'identificazione di bersagli terapeutici e lo screening farmacologico per condizioni co....

Protocol

Questo studio è stato condotto in conformità con la legge sul benessere degli animali e i regolamenti di attuazione sul benessere degli animali in conformità con i principi della Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee presso l'Università del Texas Health Science Center di San Antonio. Per una panoramica del protocollo, vedere la Figura 1; vedere la Tabella dei

Representative Results

Dopo la determinazione di una specifica proteina bersaglio e l'identificazione della sequenza genica associata, l'approccio sperimentale complessivo prevede il clonaggio della sequenza genica in un vettore retrovirale RCAS(A) mediante il clonaggio iniziale in un vettore adattatore, seguito da un vettore virale. In secondo luogo, le particelle virali ad alto titolo vengono preparate utilizzando cellule di imballaggio per raccogliere e concentrare i virioni. Questi primi due passi principali sono stati ampiamente descritti.......

Discussion

Questo modello sperimentale offre l'opportunità di esprimere la/e proteina/e di interesse nel cristallino intatto, portando allo studio della rilevanza funzionale di queste proteine nella struttura e nella funzione del cristallino. Il modello di microiniezione del pulcino embrionale si basa in parte sul lavoro di Fekete et. al.6 ed è stato ulteriormente sviluppato da Jiang et. al.8 ed è stato utilizzato come mezzo per inserire sia plasmidi virali che agenti come agonisti.......

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni del National Institutes of Health (NIH): RO1 EY012085 (a J.X.J) e F32DK134051 (a FMA) e dalla sovvenzione della Welch Foundation: AQ-1507 (a J.X.J.). Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health. Le figure sono state parzialmente create con Biorender.com.

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Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 µm FilterCorning431118For removing cellular debris from media
35 mm x 10 mm Culture DishFisherScientific50-202-030For using during microinjection
CentrifugeFisherbrand13-100-676Spinning down solution
ConstructsGENEWIZ-For generation of constructs
Dissecting microscopeAmScopeSM-4TZ-144AVisualization of lens for microinjection
DNA PCR primersIntegrated DNA Technologies-Generation of primers:

Intracellular loop (IL)-deleted Cx50 (residues 1–97 and 149–400) as well as the Cla12NCO vector were obtained with the following pair of primers: sense, CTCCTGAGAACCTACATCCT; antisense, CACCGCATGCCCAAAGTACAC

ILs of Cx43 (residues 98–150) and Cx46 (residues 98–166) were  obtained with the following pairs of primers: sense, TACGTGATGAGGAAAGAAGAG; antisense, TCCTCCACGCATCTTTACCTTG; sense, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCC AT ACGGATTC, respectively

Cla12NCO-Cx43 construct template was obtained with the following pair of primers: sense, CTGCTTCGTACTTACATCATC; antisense, GAACAC GTGCGCCAGGTAC

ILs of Cx50 (residues 98–148) or Cx46 (residues 98–166) were cloned by using Cla12NCO-Cx50 and Cla12NCO-Cx46 constructs as the templates with the following pair of primers: sense, CACCATGTCCGCATGGAGGAGA; antisense, GGTCCCC TC CAGGCGAAAC; sense, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCCATACGGATTC, respectively
Drummond Nanoject II Automatic Nanoliter InjectorDrummond Scientific3-000-204Microinjection Pipet
Dual Gooseneck Lights Microscope IlluminatorAmScopeLED-50WYLighting for visualization
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)InvitrogenFor cell culture
Egg Holder--Homemade styrofoam rings with 2-inch diameter and one-half inch height
Egg IncubatorGQF Manufacturing Company Inc.1502For incubation of fertilized eggs
Fast GreenFisher scientificF99-10For visualization of viral stock injection
Fertilized white leghorn chicken eggsTexas A&M UniversityN/AAnimal model of choice for microinjection (https://posc.tamu.edu/fertile-egg-orders/)
Fetal Bovine Serum (FBS)Hyclone LaboratoriesFor cell culture
Fluorescein-conjugated anti-mouse IgGJackson ImmunoResearch115-095-003For anti-FLAG  1:500
ForcepsFisherScientific22-327379For moving things around and isolation
Glass capillariesSutter InstrumentsB100-75-10Glass micropipette for microinjection (O.D. 1.0 mm, I.D. 0.75 mm, 10 cm length)
LipofectamineInvitrogenL3000001For transfection
Manual vertical micropipette pullerSutter InstrumentsP-30To obtain glass micropipette of the correct size
Microcentrifuge TubesFisherScientific02-682-004Dissolving solution
MicroscopeKeyenceBZ-X710For imaging staining
ParafilmFisherScientific03-448-254Placing solution
Penicillin/StreptomycinInvitrogenFor cell culture
Pico-InjectorHarvard ApparatusPLI-100For delivering small liquid volumes precisely through micropipettes by applying a regulated pressure for a digitally set period of time
rabbit anti-chick AQP0Self generated-Jiang JX, White TW, Goodenough DA, Paul DL. Molecular cloning and functional characterization of chick lens fiber connexin 45.6. Mol Biol Cell. 1994 Mar;5(3):363-73. doi: 10.1091/mbc.5.3.363.
rabbit anti-FLAG antibodyRockland Immunichemicals600-401-383For staining FLAG
Rhodamine-conjugated anti-rabbit IgG Jackson ImmunoResearch111-295-003For anti-AQP0  1:500
Sponge clamping padSutter InstrumentsBX10For storage of glass micropipette

References

  1. Li, Z., Gu, S., Quan, Y., Varadaraj, K., Jiang, J. X. Development of a potent embryonic chick lens model for studying congenital cataracts in vivo. Communications Biology. 4 (1), 325 (2021).
  2. Chen, Y., et al.

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