Microinjeção de Retrovírus RCAS(A) Recombinante em Lentes de Galinha Embrionárias

Summary

Este trabalho de protocolo descreve a metodologia de microinjeção embrionária de lente de frango de um retrovírus RCAS(A) como uma ferramenta para estudar a função in situ e a expressão de proteínas durante o desenvolvimento do cristalino.

Abstract

A galinha embrionária (Gallus domesticus) é um modelo animal bem estabelecido para o estudo do desenvolvimento e fisiologia do cristalino, dado o seu alto grau de similaridade com o cristalino humano. RCAS(A) é um retrovírus de galinha competente em replicação que infecta células em divisão, que serve como uma ferramenta poderosa para estudar a expressão in situ e a função de proteínas selvagens e mutantes durante o desenvolvimento do cristalino por microinjeção no lúmen vazio da vesícula do cristalino nos estágios iniciais de desenvolvimento, restringindo sua ação às células do cristalino em proliferação circundantes. Em comparação com outras abordagens, como modelos transgênicos e culturas ex vivo , o uso de um retrovírus aviário competente em replicação RCAS(A) fornece um sistema altamente eficaz, rápido e personalizável para expressar proteínas exógenas em embriões de pintinhos. Especificamente, a transferência gênica direcionada pode ser confinada a células de fibras proliferativas do cristalino sem a necessidade de promotores tecido-específicos. Neste artigo, faremos uma breve visão geral das etapas necessárias para a preparação de RCAS(A) de retrovírus recombinante, forneceremos uma visão geral detalhada e abrangente do procedimento de microinjeção e forneceremos resultados de amostra da técnica.

Introduction

O objetivo deste protocolo é descrever a metodologia de microinjeção embrionária de lente de frango de um RCAS(A) (replication-competente avian sarcoma/leukosis retrovirus A). A liberação retroviral efetiva em uma lente de frango embrionária tem se mostrado uma ferramenta promissora para o estudo in vivo do mecanismo molecular e da função-estrutura das proteínas do cristalino na fisiologia normal do cristalino, condições patológicas e desenvolvimento. Além disso, esse modelo experimental poderia ser utilizado para a identificação de alvos terapêuticos e triagem medicamentosa para condições como catarata congênita humana. Ao todo, esse protocolo visa estabelec....

Protocol

Este estudo foi conduzido em conformidade com a Lei de Bem-Estar Animal e os Regulamentos de Implementação de Bem-Estar Animal de acordo com os princípios do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Centro de Ciências da Saúde da Universidade do Texas em San Antonio. Para obter uma visão geral do protocolo, consulte a Figura 1; consulte a Tabela de Materiai.......

Discussion

Este modelo experimental oferece a oportunidade de expressar a(s) proteína(s) de interesse no cristalino intacto, levando ao estudo da relevância funcional dessas proteínas na estrutura e função do cristalino. O modelo de microinjeção de pintinhos embrionários é parcialmente baseado no trabalho de Fekete et. ^al.6 e foi desenvolvido por Jiang et. ^al.8 e tem sido utilizada como meio de inserção de plasmídeos virais e agentes como agonistas, pequenos RNAs interfere.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm Filter	Corning	431118	For removing cellular debris from media
35 mm x 10 mm Culture Dish	FisherScientific	50-202-030	For using during microinjection
Centrifuge	Fisherbrand	13-100-676	Spinning down solution
Constructs	GENEWIZ	-	For generation of constructs
Dissecting microscope	AmScope	SM-4TZ-144A	Visualization of lens for microinjection
DNA PCR primers	Integrated DNA Technologies	-	Generation of primers: Intracellular loop (IL)-deleted Cx50 (residues 1–97 and 149–400) as well as the Cla12NCO vector were obtained with the following pair of primers: sense, CTCCTGAGAACCTACATCCT; antisense, CACCGCATGCCCAAAGTACAC ILs of Cx43 (residues 98–150) and Cx46 (residues 98–166) were  obtained with the following pairs of primers: sense, TACGTGATGAGGAAAGAAGAG; antisense, TCCTCCACGCATCTTTACCTTG; sense, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCC AT ACGGATTC, respectively Cla12NCO-Cx43 construct template was obtained with the following pair of primers: sense, CTGCTTCGTACTTACATCATC; antisense, GAACAC GTGCGCCAGGTAC ILs of Cx50 (residues 98–148) or Cx46 (residues 98–166) were cloned by using Cla12NCO-Cx50 and Cla12NCO-Cx46 constructs as the templates with the following pair of primers: sense, CACCATGTCCGCATGGAGGAGA; antisense, GGTCCCC TC CAGGCGAAAC; sense, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCCATACGGATTC, respectively
Drummond Nanoject II Automatic Nanoliter Injector	Drummond Scientific	3-000-204	Microinjection Pipet
Dual Gooseneck Lights Microscope Illuminator	AmScope	LED-50WY	Lighting for visualization
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Invitrogen		For cell culture
Egg Holder	-	-	Homemade styrofoam rings with 2-inch diameter and one-half inch height
Egg Incubator	GQF Manufacturing Company Inc.	1502	For incubation of fertilized eggs
Fast Green	Fisher scientific	F99-10	For visualization of viral stock injection
Fertilized white leghorn chicken eggs	Texas A&M University	N/A	Animal model of choice for microinjection (https://posc.tamu.edu/fertile-egg-orders/)
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone Laboratories		For cell culture
Fluorescein-conjugated anti-mouse IgG	Jackson ImmunoResearch	115-095-003	For anti-FLAG  1:500
Forceps	FisherScientific	22-327379	For moving things around and isolation
Glass capillaries	Sutter Instruments	B100-75-10	Glass micropipette for microinjection (O.D. 1.0 mm, I.D. 0.75 mm, 10 cm length)
Lipofectamine	Invitrogen	L3000001	For transfection
Manual vertical micropipette puller	Sutter Instruments	P-30	To obtain glass micropipette of the correct size
Microcentrifuge Tubes	FisherScientific	02-682-004	Dissolving solution
Microscope	Keyence	BZ-X710	For imaging staining
Parafilm	FisherScientific	03-448-254	Placing solution
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen		For cell culture
Pico-Injector	Harvard Apparatus	PLI-100	For delivering small liquid volumes precisely through micropipettes by applying a regulated pressure for a digitally set period of time
rabbit anti-chick AQP0	Self generated	-	Jiang JX, White TW, Goodenough DA, Paul DL. Molecular cloning and functional characterization of chick lens fiber connexin 45.6. Mol Biol Cell. 1994 Mar;5(3):363-73. doi: 10.1091/mbc.5.3.363.
rabbit anti-FLAG antibody	Rockland Immunichemicals	600-401-383	For staining FLAG
Rhodamine-conjugated anti-rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch	111-295-003	For anti-AQP0  1:500
Sponge clamping pad	Sutter Instruments	BX10	For storage of glass micropipette