Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתאר ומשווה שתי שיטות מייצגות להבחנה של hiPSCs לתאי סטרומה מזנכימליים (MSCs). השיטה החד-שכבתית מאופיינת בעלות נמוכה יותר, תפעול פשוט יותר ובידול אוסטאוגני קל יותר. שיטת הגופים העובריים (EBs) מאופיינת בצריכת זמן נמוכה יותר.

Abstract

תאי סטרומה מזנכימליים (MSCs) הם תאי גזע פלוריפוטנטיים בוגרים הנמצאים בשימוש נרחב ברפואה רגנרטיבית. מכיוון שתאי MSC שמקורם ברקמה סומטית מוגבלים על ידי תרומה מוגבלת, שינויי איכות ובטיחות ביולוגית, בעשר השנים האחרונות חלה עלייה גדולה במאמצים לייצר MSCs מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSCs). מאמצים קודמים ואחרונים בהתמיינות של hiPSCs ל- MSCs התרכזו סביב שתי מתודולוגיות תרבית: (1) היווצרות גופים עובריים (EBs) ו- (2) שימוש בתרבית חד-שכבתית. פרוטוקול זה מתאר שתי שיטות מייצגות אלה בהפקת MSC מ- hiPSCs. כל שיטה מציגה את יתרונותיה וחסרונותיה, לרבות זמן, עלות, יכולת התפשטות תאים, ביטוי סמני MSC ויכולת התמיינות שלהם במבחנה. פרוטוקול זה מדגים כי שתי השיטות יכולות להפיק MSCs בוגרים ופונקציונליים מ- hiPSCs. שיטת החד-שכבתית מאופיינת בעלות נמוכה יותר, תפעול פשוט יותר ובידול אוסטאוגני קל יותר, ואילו שיטת EB מאופיינת בצריכת זמן נמוכה יותר.

Introduction

תאי סטרומה מזנכימליים (MSCs) הם תאי גזע פלוריפוטנטיים בוגרים שמקורם במזודרם1. MSCs נמצאים כמעט בכל רקמות החיבור2. מאז MSCs התגלו לראשונה בשנת 1970 ובודדו בהצלחה ממח עצם בשנת 1987 על ידי Friedenstein et al.3,4,5, מגוון של רקמות סומטיות אנושיות (כולל עובריות ובוגרות) שימשו לבידוד MSCs כגון עצם, סחוס, גיד, שריר, רקמת שומן, סטרומה תומכת hematopoietic 1,2,6,7 . MSCs מפגינים יכולות שגשוג גבוהות ופלסטיות כדי ....

Protocol

1. תחזוקת hiPSCs

  1. הפשרת hiPSC
    1. הוציאו את התאים מהחנקן הנוזלי והפשירו במהירות תאים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. מעבירים את תאי ההפשרה לצינור 15 מ"ל שהוכן עם 3 מ"ל של אמצעי תחזוקה iPSC (טבלת חומרים). מערבבים בעדינות את המדיום.
    2. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות. הסר את supernat.......

Representative Results

בעקבות הפרוטוקול (איור 1A), hiPSCs התמינו ל-MSCs באמצעות שיטות היווצרות EB ותרבית חד-שכבתית. במהלך ההתמיינות, התאים הראו מורפולוגיות מייצגות שונות (איור 1B,C).

כפי שניתן לראות באיור 1B, מושבות hiPSCs מציגות מורפולוגיה קומפקטית טיפ.......

Discussion

בפרוטוקול זה נבדקו שתי שיטות מייצגות להבחנה בין hiPSCs ל-MSCs: 20,21,22,23,24,25,26,27,28,30. שתי השיטות היו מסוגלות לגזור.......

Acknowledgements

אנו אסירי תודה לכל חברי מעבדת מאו והו, בעבר ובהווה, על הדיונים המעניינים והתרומות הגדולות לפרויקט. אנו מודים למרכז המחקר הקליני הלאומי לבריאות הילד על התמיכה הגדולה. מחקר זה נתמך כספית על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (U20A20351 לג'יאנהואה מאו, 82200784 ללידן הו), הקרן למדעי הטבע של מחוז ג'ג'יאנג בסין (No. LQ22C070004 ללידן הו).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Alizarin red staining kitBeyotime BiotechnologyC0148S
Anti-human-CD105 (PE)Biolegend323206
Anti-human-CD34 (FITC)Biolegend343503
Anti-human-CD45 (APC)Biolegend304011
Anti-human-CD73( APC)Biolegend344006
Anti-human-CD90 (FITC)Biolegend328108
Ascorbic acidSolarbioA8100
BMP-6NovoproteinC012
Carbon dioxide level shakerCrystalCO-06UC6
Compensation BeadsBioLegend424601
CryoStor CS10STEMCELL Technology07959
DexamethasoneBeyotime BiotechnologyST1254
DMEM/F12  mediumServicebioG4610
Fetal bovine serumHAKATAHS-FBS-500
FGF2Stemcell78003.1
GelatinSigma-AldrichG2500-100G
GlutaMAXGibco35050061
human IgG1 isotype control APCBioLegend403505
human IgG1 isotype control FITCBioLegend403507
human IgG1 isotype control PEBioLegend403503
Human TGF-β1Stemcell78067
Human TruStain FcX BioLegend422301
IBMXBeyotime BiotechnologyST1398
IndomethacinSolarbioSI9020
InsulinBeyotime BiotechnologyP3376
iPSC maintenance mediumSTEMCELL Technology85850
ITS Media SupplementBeyotime BiotechnologyC0341-10mL
Matrigel, growth factor reducedBD Corning354230
Oli Red O staining kitBeyotime BiotechnologyC0158S
ProlineSolarbioP0011
Sodium pyruvateThermoFisher11360-070
TGFβ3NovoproteinCJ44
Toluidine blue staining kitSolarbioG2543
TrypLE Express Enzyme(1x) Gibco12604013
Ultra-Low Attachment 6 Well PlateCostar3471
VerseneGibco15040-66
Y-27632Stemcell72304
α-MEMHycloneSH30265
β-glycerophosphateSolarbioG8100

References

  1. Weng, Z., et al. Mesenchymal stem/stromal cell senescence: Hallmarks, mechanisms, and combating strategies. Stem Cells Translational Medicine. 11 (4), 356-371 (2022).
  2. Soliman, H., et al. Multipotent stromal....

Explore More Articles

MSCsHiPSCsMSCMSCs

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved