השוואה בין שתי שיטות מייצגות להתמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם לתאי סטרומה מזנכימליים

Summary

פרוטוקול זה מתאר ומשווה שתי שיטות מייצגות להבחנה של hiPSCs לתאי סטרומה מזנכימליים (MSCs). השיטה החד-שכבתית מאופיינת בעלות נמוכה יותר, תפעול פשוט יותר ובידול אוסטאוגני קל יותר. שיטת הגופים העובריים (EBs) מאופיינת בצריכת זמן נמוכה יותר.

Abstract

תאי סטרומה מזנכימליים (MSCs) הם תאי גזע פלוריפוטנטיים בוגרים הנמצאים בשימוש נרחב ברפואה רגנרטיבית. מכיוון שתאי MSC שמקורם ברקמה סומטית מוגבלים על ידי תרומה מוגבלת, שינויי איכות ובטיחות ביולוגית, בעשר השנים האחרונות חלה עלייה גדולה במאמצים לייצר MSCs מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSCs). מאמצים קודמים ואחרונים בהתמיינות של hiPSCs ל- MSCs התרכזו סביב שתי מתודולוגיות תרבית: (1) היווצרות גופים עובריים (EBs) ו- (2) שימוש בתרבית חד-שכבתית. פרוטוקול זה מתאר שתי שיטות מייצגות אלה בהפקת MSC מ- hiPSCs. כל שיטה מציגה את יתרונותיה וחסרונותיה, לרבות זמן, עלות, יכולת התפשטות תאים, ביטוי סמני MSC ויכולת התמיינות שלהם במבחנה. פרוטוקול זה מדגים כי שתי השיטות יכולות להפיק MSCs בוגרים ופונקציונליים מ- hiPSCs. שיטת החד-שכבתית מאופיינת בעלות נמוכה יותר, תפעול פשוט יותר ובידול אוסטאוגני קל יותר, ואילו שיטת EB מאופיינת בצריכת זמן נמוכה יותר.

Introduction

תאי סטרומה מזנכימליים (MSCs) הם תאי גזע פלוריפוטנטיים בוגרים שמקורם במזודרם¹. MSCs נמצאים כמעט בכל רקמות החיבור². מאז MSCs התגלו לראשונה בשנת 1970 ובודדו בהצלחה ממח עצם בשנת 1987 על ידי Friedenstein et al.3,4,5, מגוון של רקמות סומטיות אנושיות (כולל עובריות ובוגרות) שימשו לבידוד MSCs כגון עצם, סחוס, גיד, שריר, רקמת שומן, סטרומה תומכת hematopoietic 1,2,6,7 . MSCs מפגינים יכולות שגשוג גבוהות ופלסטיות כדי ....

Protocol

1. תחזוקת hiPSCs

1. הפשרת hiPSC
   1. הוציאו את התאים מהחנקן הנוזלי והפשירו במהירות תאים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. מעבירים את תאי ההפשרה לצינור 15 מ"ל שהוכן עם 3 מ"ל של אמצעי תחזוקה iPSC (טבלת חומרים). מערבבים בעדינות את המדיום.
   2. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות. הסר את supernat.......

Discussion

בפרוטוקול זה נבדקו שתי שיטות מייצגות להבחנה בין hiPSCs ל-MSCs: 20,21,22,23,24,25,26,27,28,30. שתי השיטות היו מסוגלות לגזור.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alizarin red staining kit	Beyotime Biotechnology	C0148S
Anti-human-CD105 (PE)	Biolegend	323206
Anti-human-CD34 (FITC)	Biolegend	343503
Anti-human-CD45 (APC)	Biolegend	304011
Anti-human-CD73( APC)	Biolegend	344006
Anti-human-CD90 (FITC)	Biolegend	328108
Ascorbic acid	Solarbio	A8100
BMP-6	Novoprotein	C012
Carbon dioxide level shaker	Crystal	CO-06UC6
Compensation Beads	BioLegend	424601
CryoStor CS10	STEMCELL Technology	07959
Dexamethasone	Beyotime Biotechnology	ST1254
DMEM/F12  medium	Servicebio	G4610
Fetal bovine serum	HAKATA	HS-FBS-500
FGF2	Stemcell	78003.1
Gelatin	Sigma-Aldrich	G2500-100G
GlutaMAX	Gibco	35050061
human IgG1 isotype control APC	BioLegend	403505
human IgG1 isotype control FITC	BioLegend	403507
human IgG1 isotype control PE	BioLegend	403503
Human TGF-β1	Stemcell	78067
Human TruStain FcX	BioLegend	422301
IBMX	Beyotime Biotechnology	ST1398
Indomethacin	Solarbio	SI9020
Insulin	Beyotime Biotechnology	P3376
iPSC maintenance medium	STEMCELL Technology	85850
ITS Media Supplement	Beyotime Biotechnology	C0341-10mL
Matrigel, growth factor reduced	BD Corning	354230
Oli Red O staining kit	Beyotime Biotechnology	C0158S
Proline	Solarbio	P0011
Sodium pyruvate	ThermoFisher	11360-070
TGFβ3	Novoprotein	CJ44
Toluidine blue staining kit	Solarbio	G2543
TrypLE Express Enzyme(1x)	Gibco	12604013
Ultra-Low Attachment 6 Well Plate	Costar	3471
Versene	Gibco	15040-66
Y-27632	Stemcell	72304
α-MEM	Hyclone	SH30265
β-glycerophosphate	Solarbio	G8100