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  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Células mononucleares isoladas do sangue periférico podem ser usadas para a análise de funções e distúrbios imunológicos, doenças metabólicas ou funções mitocondriais. Neste trabalho, descrevemos um método padronizado para o preparo de CMSP a partir de sangue total e posterior criopreservação. A criopreservação torna esse tempo e lugar independentes.

Abstract

As funções fisiológicas das células eucarióticas dependem da energia fornecida principalmente pelas mitocôndrias. A disfunção mitocondrial está ligada a doenças metabólicas e ao envelhecimento. A fosforilação oxidativa desempenha um papel decisivo, pois é crucial para a manutenção da homeostase energética. PBMCs foram identificados como uma amostra minimamente invasiva para medir a função mitocondrial e demonstraram refletir condições da doença. No entanto, a mensuração da função bioenergética mitocondrial pode ser limitada por vários fatores em amostras humanas. As limitações são a quantidade de amostras coletadas, o tempo de amostragem, que muitas vezes é distribuído por vários dias, e os locais. A criopreservação das amostras coletadas pode garantir a coleta e a medição consistentes das amostras. Deve-se tomar cuidado para garantir que os parâmetros medidos sejam comparáveis entre células criopreservadas e recém-preparadas. Aqui, descrevemos métodos de isolamento e criopreservação de CMSP de amostras de sangue humano para analisar a função bioenergética das mitocôndrias nessas células. As CMSP criopreservadas de acordo com o protocolo aqui descrito mostram apenas pequenas diferenças no número e viabilidade celular, nos níveis de trifosfato de adenosina e na atividade da cadeia respiratória medida em comparação com células recém-colhidas. Apenas 8-24 mL de sangue humano são necessários para as preparações descritas, tornando possível coletar amostras durante estudos clínicos multicentralmente e determinar sua bioenergética no local.

Introduction

As células mononucleares do sangue periférico humano (CMSP) são utilizadas para diversas aplicações em diversos campos científicos, incluindo o estudo de questões imunológicas e bioenergéticas, como aquelas relacionadas a processos de envelhecimento ou doenças degenerativas 1,2. As CMSP são heterogêneas em composição e consistem de linfócitos (células B, células T e células NK), monócitos e células dendríticas. As células às vezes mostram grandes diferenças individuais e variações dentro de um sujeito, então procedimentos padronizados para lidar com essas células são necessários. Parâmetros importantes como vi....

Protocol

Todos os protocolos descritos neste manuscrito para coleta, isolamento e análise de sangue foram revisados e aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade de Giessen, Alemanha. Obteve-se o consentimento dos pacientes para inclusão de suas amostras no estudo. Todas as etapas de isolamento e cultura celular são realizadas sob um gabinete de segurança biológica.

1. Punção venosa

  1. Preparar todo o equipamento necessário para a coleta de sangue, inclu.......

Representative Results

Viabilidade e número de células
Para obter sucesso no isolamento e criopreservação, a contagem e a viabilidade celular devem ser as mais altas possíveis. Antes e depois da criopreservação, as células são contadas, e sua viabilidade é determinada para garantir a saúde e a qualidade das células. A Figura 3 é uma ilustração representativa das CMSP antes e após a criopreservação, a contagem de células e a viabilidade dificilmente diferem. Isso indica o isol.......

Discussion

Este protocolo fornece um meio de isolar e criopreservar células mononucleares do sangue periférico (CMSP) do sangue humano de forma adequada para análises bioenergéticas. O método descrito oferece a possibilidade de isolar CMSP suavemente e em grandes quantidades, com alta viabilidade e células suficientes para medidas bioenergéticas. Tem a desvantagem de que, mesmo com interrupções mínimas, ocorrem longos isolamentos, mas a criopreservação subsequente permite uma medição independente do tempo da bioenerg?.......

Disclosures

Os autores declaram a inexistência de conflitos de interesse.

Acknowledgements

Agradecemos à equipe clínica do Hospital Universitário Giessen-Marburg pela coleta de sangue. Este trabalho foi financiado pela universidade Justus Liebig.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.1 M Triethanolamine-HCl-Buffer (pH = 8,0)Self-prepared-
0.5 M Triethanolamine-HCl-BufferSelf-prepared-
1.0 M Tris-HCl-Buffer (pH = 8,1)Self-prepared-
1.01 mM DTBBSelf-prepared-
10 % Triton X-100Self-prepared-
10 mM OxalacetatSelf-prepared-
14–20 G sterile blood draw needles Multi Adapter Sarstedt Safety-MultiflySarstedt156353_v
37% HClCarl Roth GmbH & Co. KG-
70% Ethanol (EtOH)Self-prepared-
Acetyl-CoAPancreac ApplichemA3753
ADPSigma-AldrichA5285
Alcohol wipes (70% isopropyl alcohol)
Antimycin ASigma-AldrichA8674
Aqua (bidest.)With MilliQ Academic (self-made)-
AscorbateSigma-AldrichA4034
ATP-StandardSigma-Aldrich6016949
Biocoll Seperating SolutionBiochrom6115
Biological safty cabinet MSC AdvantageThermo Fisher Scientific Inc.
Carbonylcyanid-p-trifluoromethoxy-phenylhydrazon (FCCP)Sigma-AldrichC2920
Cell counter TC20 Automated Cell CounterBio-Rad
Centrifuge Heraeus Megafuge 16 RThermo Fisher Scientific Inc.
Counting slides, dual chamber for cell counterBio-Rad1450016
Cryotube Cryo.SGrainer Bio-One126263-2DG
DigitoninSigma-Aldrich37008
Dimethylsulfoxid (DMSO)Merck102952
Disinfection spray
Disposable gloves latex, rubber, or vinyl.
Distrips (12.5 ml) DistriTipsGilsonF164150
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS; 10x)Gibco (Thermo Scientific)15217168
Ethanol (EtOH 100%)Carl ROTH GmbH & Co. KG9065.3
Fetal bovine serum (FBS)Sigma-AldrichF9665
Frezer (-80°C)Thermo Fisher Scientific Inc.
GlutamateSigma-AldrichG1626
Holder/adapter 
Incubator Midi 40 CO2Thermo Fisher Scientific Inc.
Injection syringeHamilton
MalateSigma-AldrichM-1000
MIR05Self-prepared-
Mr. Frosty Freezing ContainerThermo Fisher Scientific Inc.10110051
Multireader CLARIOstarBMG Labtech
Nitrogen tank Locator 6 plusThermo Fisher Scientific Inc.
OligomycinSigma-AldrichO4876
OxalacetateSigma-Aldrich-
Oxygraph-2kOrobororus Instruments
Penicillin-StreptomycinPAA15140122
Pipettes Performance Pipettor 10 μL, 100 μL, 1000 μLVWR
Roswell-Park. Memorial-Institute-Medium (RPMI-1640)Gibco (Thermo Scientific)11530586
RotenoneSigma-AldrichR8875
SaccharoseCarl ROTH GmbH & Co. KG9286.2
Sodium azideSigma-AldrichS2002
SuccinateSigma-AldrichS2378
Tetramethylphenylendiamin (TMPD)Sigma-AldrichT3134
Tourniquet/ Blood pressure cuff
Tris(hydroxymethyl)amino-methaneSigma-Aldrich108382
Triton X-100Sigma-Aldrich108643
TrypanblauBiochromT6146
Vacuum pumpVaccubrand GmbH & Co.
ViewPlate-96Perkin Elmer6005181
Water bath WNB22Memmert GmbH & Co. KG

References

  1. Mancuso, M., et al. Mitochondria, cognitive impairment, and Alzheimer's disease. Int J Alzheimers Dis. 2009, 951548 (2009).
  2. Haas, R. H. Mitochondrial dysfunction in aging and diseases of aging. Biology....

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