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Células mononucleares isoladas do sangue periférico podem ser usadas para a análise de funções e distúrbios imunológicos, doenças metabólicas ou funções mitocondriais. Neste trabalho, descrevemos um método padronizado para o preparo de CMSP a partir de sangue total e posterior criopreservação. A criopreservação torna esse tempo e lugar independentes.
As funções fisiológicas das células eucarióticas dependem da energia fornecida principalmente pelas mitocôndrias. A disfunção mitocondrial está ligada a doenças metabólicas e ao envelhecimento. A fosforilação oxidativa desempenha um papel decisivo, pois é crucial para a manutenção da homeostase energética. PBMCs foram identificados como uma amostra minimamente invasiva para medir a função mitocondrial e demonstraram refletir condições da doença. No entanto, a mensuração da função bioenergética mitocondrial pode ser limitada por vários fatores em amostras humanas. As limitações são a quantidade de amostras coletadas, o tempo de amostragem, que muitas vezes é distribuído por vários dias, e os locais. A criopreservação das amostras coletadas pode garantir a coleta e a medição consistentes das amostras. Deve-se tomar cuidado para garantir que os parâmetros medidos sejam comparáveis entre células criopreservadas e recém-preparadas. Aqui, descrevemos métodos de isolamento e criopreservação de CMSP de amostras de sangue humano para analisar a função bioenergética das mitocôndrias nessas células. As CMSP criopreservadas de acordo com o protocolo aqui descrito mostram apenas pequenas diferenças no número e viabilidade celular, nos níveis de trifosfato de adenosina e na atividade da cadeia respiratória medida em comparação com células recém-colhidas. Apenas 8-24 mL de sangue humano são necessários para as preparações descritas, tornando possível coletar amostras durante estudos clínicos multicentralmente e determinar sua bioenergética no local.
As células mononucleares do sangue periférico humano (CMSP) são utilizadas para diversas aplicações em diversos campos científicos, incluindo o estudo de questões imunológicas e bioenergéticas, como aquelas relacionadas a processos de envelhecimento ou doenças degenerativas 1,2. As CMSP são heterogêneas em composição e consistem de linfócitos (células B, células T e células NK), monócitos e células dendríticas. As células às vezes mostram grandes diferenças individuais e variações dentro de um sujeito, então procedimentos padronizados para lidar com essas células são necessários. Parâmetros importantes como vi....
Todos os protocolos descritos neste manuscrito para coleta, isolamento e análise de sangue foram revisados e aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade de Giessen, Alemanha. Obteve-se o consentimento dos pacientes para inclusão de suas amostras no estudo. Todas as etapas de isolamento e cultura celular são realizadas sob um gabinete de segurança biológica.
1. Punção venosa
Viabilidade e número de células
Para obter sucesso no isolamento e criopreservação, a contagem e a viabilidade celular devem ser as mais altas possíveis. Antes e depois da criopreservação, as células são contadas, e sua viabilidade é determinada para garantir a saúde e a qualidade das células. A Figura 3 é uma ilustração representativa das CMSP antes e após a criopreservação, a contagem de células e a viabilidade dificilmente diferem. Isso indica o isol.......
Este protocolo fornece um meio de isolar e criopreservar células mononucleares do sangue periférico (CMSP) do sangue humano de forma adequada para análises bioenergéticas. O método descrito oferece a possibilidade de isolar CMSP suavemente e em grandes quantidades, com alta viabilidade e células suficientes para medidas bioenergéticas. Tem a desvantagem de que, mesmo com interrupções mínimas, ocorrem longos isolamentos, mas a criopreservação subsequente permite uma medição independente do tempo da bioenerg?.......
Agradecemos à equipe clínica do Hospital Universitário Giessen-Marburg pela coleta de sangue. Este trabalho foi financiado pela universidade Justus Liebig.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.1 M Triethanolamine-HCl-Buffer (pH = 8,0) | Self-prepared | - | |
0.5 M Triethanolamine-HCl-Buffer | Self-prepared | - | |
1.0 M Tris-HCl-Buffer (pH = 8,1) | Self-prepared | - | |
1.01 mM DTBB | Self-prepared | - | |
10 % Triton X-100 | Self-prepared | - | |
10 mM Oxalacetat | Self-prepared | - | |
14–20 G sterile blood draw needles Multi Adapter Sarstedt Safety-Multifly | Sarstedt | 156353_v | |
37% HCl | Carl Roth GmbH & Co. KG | - | |
70% Ethanol (EtOH) | Self-prepared | - | |
Acetyl-CoA | Pancreac Applichem | A3753 | |
ADP | Sigma-Aldrich | A5285 | |
Alcohol wipes | (70% isopropyl alcohol) | ||
Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
Aqua (bidest.) | With MilliQ Academic (self-made) | - | |
Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | |
ATP-Standard | Sigma-Aldrich | 6016949 | |
Biocoll Seperating Solution | Biochrom | 6115 | |
Biological safty cabinet MSC Advantage | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
Carbonylcyanid-p-trifluoromethoxy-phenylhydrazon (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
Cell counter TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | ||
Centrifuge Heraeus Megafuge 16 R | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
Counting slides, dual chamber for cell counter | Bio-Rad | 1450016 | |
Cryotube Cryo.S | Grainer Bio-One | 126263-2DG | |
Digitonin | Sigma-Aldrich | 37008 | |
Dimethylsulfoxid (DMSO) | Merck | 102952 | |
Disinfection spray | |||
Disposable gloves latex, rubber, or vinyl. | |||
Distrips (12.5 ml) DistriTips | Gilson | F164150 | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS; 10x) | Gibco (Thermo Scientific) | 15217168 | |
Ethanol (EtOH 100%) | Carl ROTH GmbH & Co. KG | 9065.3 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | |
Frezer (-80°C) | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
Glutamate | Sigma-Aldrich | G1626 | |
Holder/adapter | |||
Incubator Midi 40 CO2 | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
Injection syringe | Hamilton | ||
Malate | Sigma-Aldrich | M-1000 | |
MIR05 | Self-prepared | - | |
Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific Inc. | 10110051 | |
Multireader CLARIOstar | BMG Labtech | ||
Nitrogen tank Locator 6 plus | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | |
Oxalacetate | Sigma-Aldrich | - | |
Oxygraph-2k | Orobororus Instruments | ||
Penicillin-Streptomycin | PAA | 15140122 | |
Pipettes Performance Pipettor 10 μL, 100 μL, 1000 μL | VWR | ||
Roswell-Park. Memorial-Institute-Medium (RPMI-1640) | Gibco (Thermo Scientific) | 11530586 | |
Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
Saccharose | Carl ROTH GmbH & Co. KG | 9286.2 | |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
Succinate | Sigma-Aldrich | S2378 | |
Tetramethylphenylendiamin (TMPD) | Sigma-Aldrich | T3134 | |
Tourniquet/ Blood pressure cuff | |||
Tris(hydroxymethyl)amino-methane | Sigma-Aldrich | 108382 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 108643 | |
Trypanblau | Biochrom | T6146 | |
Vacuum pump | Vaccubrand GmbH & Co. | ||
ViewPlate-96 | Perkin Elmer | 6005181 | |
Water bath WNB22 | Memmert GmbH & Co. KG |
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