Криоконсервация и биоэнергетическая оценка мононуклеарных клеток периферической крови человека

Summary

Изолированные мононуклеарные клетки периферической крови могут быть использованы для анализа иммунных функций и нарушений, метаболических заболеваний или митохондриальных функций. В данной работе описан стандартизированный метод получения МПМК из цельной крови и последующей криоконсервации. Криоконсервация делает это время и место независимым.

Abstract

Физиологические функции эукариотических клеток зависят от энергии, в основном обеспечиваемой митохондриями. Митохондриальная дисфункция связана с метаболическими заболеваниями и старением. Окислительное фосфорилирование играет решающую роль, так как оно имеет решающее значение для поддержания энергетического гомеостаза. PBMC были идентифицированы как минимально инвазивный образец для измерения митохондриальной функции и, как было показано, отражают состояние заболевания. Однако измерение биоэнергетической функции митохондрий может быть ограничено несколькими факторами в образцах человека. Ограничениями являются количество взятых проб, время отбора проб, которое часто растягивается на несколько дней, и местоположение. Криоконсервация собранных образцов может обеспечить последовательный сбор и измерение образцов. Следует позаботиться о том, чтобы измеренные параметры были сопоставимы между криоконсервированными и свежеприготовленными клетками. В этой статье мы опишем методы выделения и криоконсервации МПМК из образцов крови человека для анализа биоэнергетической функции митохондрий в этих клетках. Криоконсервированные PBMC в соответствии с протоколом, описанным здесь, показывают лишь незначительные различия в количестве и жизнеспособности клеток, уровнях аденозинтрифосфата и измеренной активности дыхательной цепи по сравнению со свежесобранными клетками. Для описываемых препаратов необходимо всего 8-24 мл человеческой крови, что позволяет проводить многоцентральный отбор образцов в ходе клинических исследований и определять их биоэнергетику на месте.

Introduction

Мононуклеарные клетки периферической крови человека (МПКМ) используются для различных применений во многих научных областях, включая изучение иммунологических и биоэнергетических проблем, таких как те, которые связаны с процессами старения или дегенеративными заболеваниями ^1,2. ПБМК неоднородны по составу и состоят из лимфоцитов (В-клеток, Т-клеток и NK-клеток), моноцитов и дендритных клеток. Клетки иногда демонстрируют большие индивидуальные различия и вариации в пределах одного субъекта, поэтому требуются стандартизированные процедуры для работы с этими клетками. Такие важные параметры, как жизнеспособность ....

Protocol

Все протоколы сбора, изоляции и анализа крови, описанные в данной рукописи, были рассмотрены и одобрены Институциональным наблюдательным советом Гиссенского университета, Германия. Получено согласие пациентов на включение их образцов в исследование. Все этапы выделения и культивиров.......

Discussion

Этот протокол обеспечивает возможность выделения и криоконсервации мононуклеарных клеток периферической крови (МПКМ) из крови человека способом, подходящим для биоэнергетического анализа. Описанный метод позволяет мягко и в больших количествах выделять МПМК с высокой жизнеспособно.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 M Triethanolamine-HCl-Buffer (pH = 8,0)	Self-prepared	-
0.5 M Triethanolamine-HCl-Buffer	Self-prepared	-
1.0 M Tris-HCl-Buffer (pH = 8,1)	Self-prepared	-
1.01 mM DTBB	Self-prepared	-
10 % Triton X-100	Self-prepared	-
10 mM Oxalacetat	Self-prepared	-
14–20 G sterile blood draw needles Multi Adapter Sarstedt Safety-Multifly	Sarstedt	156353_v
37% HCl	Carl Roth GmbH & Co. KG	-
70% Ethanol (EtOH)	Self-prepared	-
Acetyl-CoA	Pancreac Applichem	A3753
ADP	Sigma-Aldrich	A5285
Alcohol wipes			(70% isopropyl alcohol)
Antimycin A	Sigma-Aldrich	A8674
Aqua (bidest.)	With MilliQ Academic (self-made)	-
Ascorbate	Sigma-Aldrich	A4034
ATP-Standard	Sigma-Aldrich	6016949
Biocoll Seperating Solution	Biochrom	6115
Biological safty cabinet MSC Advantage	Thermo Fisher Scientific Inc.
Carbonylcyanid-p-trifluoromethoxy-phenylhydrazon (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920
Cell counter TC20 Automated Cell Counter	Bio-Rad
Centrifuge Heraeus Megafuge 16 R	Thermo Fisher Scientific Inc.
Counting slides, dual chamber for cell counter	Bio-Rad	1450016
Cryotube Cryo.S	Grainer Bio-One	126263-2DG
Digitonin	Sigma-Aldrich	37008
Dimethylsulfoxid (DMSO)	Merck	102952
Disinfection spray
Disposable gloves latex, rubber, or vinyl.
Distrips (12.5 ml) DistriTips	Gilson	F164150
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS; 10x)	Gibco (Thermo Scientific)	15217168
Ethanol (EtOH 100%)	Carl ROTH GmbH & Co. KG	9065.3
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F9665
Frezer (-80°C)	Thermo Fisher Scientific Inc.
Glutamate	Sigma-Aldrich	G1626
Holder/adapter
Incubator Midi 40 CO2	Thermo Fisher Scientific Inc.
Injection syringe	Hamilton
Malate	Sigma-Aldrich	M-1000
MIR05	Self-prepared	-
Mr. Frosty Freezing Container	Thermo Fisher Scientific Inc.	10110051
Multireader CLARIOstar	BMG Labtech
Nitrogen tank Locator 6 plus	Thermo Fisher Scientific Inc.
Oligomycin	Sigma-Aldrich	O4876
Oxalacetate	Sigma-Aldrich	-
Oxygraph-2k	Orobororus Instruments
Penicillin-Streptomycin	PAA	15140122
Pipettes Performance Pipettor 10 μL, 100 μL, 1000 μL	VWR
Roswell-Park. Memorial-Institute-Medium (RPMI-1640)	Gibco (Thermo Scientific)	11530586
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875
Saccharose	Carl ROTH GmbH & Co. KG	9286.2
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002
Succinate	Sigma-Aldrich	S2378
Tetramethylphenylendiamin (TMPD)	Sigma-Aldrich	T3134
Tourniquet/ Blood pressure cuff
Tris(hydroxymethyl)amino-methane	Sigma-Aldrich	108382
Triton X-100	Sigma-Aldrich	108643
Trypanblau	Biochrom	T6146
Vacuum pump	Vaccubrand GmbH & Co.
ViewPlate-96	Perkin Elmer	6005181
Water bath WNB22	Memmert GmbH & Co. KG