피규어는 Adobe Illustrator(버전 2023) 및 Servier Medical Art (https://smart.servier.com)를 사용하여 생성되었습니다. Antonia Henes는 Jürgen Manchot Stiftung의 지원을 받았습니다.

자가면역 마우스에서 모든 CNS 상주 세포 유형을 동시에 분리

모든 저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

지금까지, 질량 분석법과 RNA 시퀀싱을 결합하여 생체 외 CNS 상주 세포를 매핑하는 방법은 건강과 질병에서 매우 정확한 세포 프로파일링을 제공하지만, 이 분야에 대한 야심찬 기술 지식과 전문 지식을 필요로 한다50,51. 또한 기능 분석을 허용하지 않으며 비용이 많이 듭니다. 저것외에, microfluidic 두뇌에 칩 체계는 질병 기계장치를 급속하고 적당한 검열 및 세포 성장과 이동의 제한과 가진 새로운 치료 접근의 시험을 제공한다 52,53,54,55. CNS 오가노이드는 또한 향후 세포 모델링, 세포 간 연결 및 질병 과정 중 상호 작용 조사를 위한 동등한 대안이 될 수 있습니다 56,57,58,59. 그러나 형광 및 자기 활성화 세포 분류는 현재 순수하고 생존 가능한 단일 세포 현탁액을 생체 외 35,60,61을 생성하는 가장 효과적인 방법입니다. CNS-상주 세포 유형의 분리를 위해 확립된 다른 제조 프로토콜이 자기 분리 및 이전 세포 해리의 개별 단계와 관련하여 유사하더라도, 각 세포 유형에 대해 개별적으로 수행되도록 의도되었습니다. 대조적으로, 현재 프로토콜은 각 CNS 상주 셀 유형에 대해 서로 다른 분리 방법을 논리적 컨텍스트에 통합하여 한 번에 동시에 그리고 하나의 단일 CNS 셀 현탁액에서 수행할 수 있습니다(표 1, 표 2). 따라서 단일 CNS 세포 현탁액에서 다중 오믹스 분석을 가능하게 하고 궁극적으로 복잡한 신경 네트워크의 탐색을 가능하게 합니다. 이 프로토콜을 수행하기 위해 여러 동물의 여러 조직을 풀링해야 하는 것은 아니지만, 이 풀링은 추가 다운스트림 분석을 위해 적절한 수의 분리된 세포를 보장합니다. 단일 세포 유형의 분리를 위해 다른 마우스를 사용하는 것은 잠재적인 세포 상호 작용을 분석할 가능성을 배제합니다. 그 외에도 이전 CNS 분리를 따르는 다양한 CNS 세포 유형에 대한 개별 분리 방법을 결합하면 이후의 모든 자기 분리 단계에 대해 하나의 해리된 CNS 세포 현탁액을 사용하여 재료 비용을 절감할 수 있습니다. 또한 다른 마우스의 사용으로 인한 잠재적인 기술적 편향이 최소화됩니다.
프로토콜의 한 가지 한계는 암컷 C57BL/6J 마우스를 거의 독점적으로 사용할 수 있다는 것입니다. EAE 면역 프로토콜은 암컷 마우스를 위해 설계 및 설정되었으므로 이 세포 분리 프로토콜은 암컷 C57BL/6J 마우스에서도 구현되었습니다. 그럼에도 불구하고, 순진한 수컷 마우스는 또한 이 프로토콜의 개발 중에 사용되었으며, 결과 세포 수 또는 순도에 대한 어떠한 영향도 인식하지 못했습니다. 또 다른 제한은 뉴런의 자성 세포 분리에 영향을 미치는데, 이는 양성 선택의 관점에서 뉴런의 분리를 위한 특정 마이크로 비드가 존재하지 않기 때문입니다. 순수한 단세포 현탁액은 모든 비신경 세포의 비오틴 라벨링 및 고갈을 통해 얻을 수 있다고 가정했습니다(표 2). 이 가정은 언급된 유세포 분석 순도 패널에 통합된 뉴런에 대한 특정 핵 마커로 NeuN을 사용하여 확인되었습니다. 또 다른 한계는 EAE 마우스에서 미세아교세포의 분리에 관한 것입니다. 여기서, MACS 프로토콜 이후의 추가적인 분류 단계 때문에 다른 셀 타입에 비해 결과적인 셀 수율이 감소한다. 더욱이, 분류가 다른 세포 집단에 비해 미세아교세포의 기계적 스트레스를 증가시킨다고 주장할 수 있습니다. 개별 분류 전략에 따라 세포 수율의 양이 달라질 수 있습니다. 격리된 셀 수가 예상보다 적거나 원하는 경우 게이팅 설정을 조정하거나 살아있는/죽은 판별을 개선하는 것이 좋습니다.
프로토콜의 중요한 단계는 잔해물 제거입니다. 그래디언트는 원하는 세 개의 개별 위상을 만들기 위해 매우 천천히 부드럽게 계층화되어야 합니다(그림 2A). 두 개의 최상위 단계에서 미엘린 및 기타 이물질 잔류물이 완전히 제거되는 경우에만 (그림 2E) 순수한 단일 세포 현탁액을 생성할 수 있으며 추가 오염을 줄일 수 있습니다. 생성된 세포 현탁액에 순도가 부족한 경우, 이는 모든 마이크로 비드의 올바른 사용을 보장하기 위해 가장 먼저 개선되어야 하는 프로토콜 섹션일 수 있습니다.
이러한 유형의 실험에서는 높은 수준의 순도와 생존율을 얻는 것이 어려울 수 있습니다. 문제 해결을 위한 몇 가지 권장 사항은 다음과 같습니다.
-멸균 조건에서 작업하는 것은 다양한 마이크로 비드의 오염을 방지하고 특히 후속 배양을 위해 반복 사용을 가능하게 하는 데 필수입니다. - 혼동을 방지하기 위해 각 튜브에 라벨을 부착하는 것이 좋습니다. - 냉각되지 않은 시약/완충액의 사용을 피하십시오. 높은 생존력을 보장하기 위해 전체 실험 동안 모든 세포 현탁액을 얼음 위에 보관하십시오. - 서로 다른 작업 단계 사이의 시간을 가능한 한 짧게 유지하십시오. 프로토콜에는 실험 일시 중지를 권장하는 특정 부분이 없습니다. -지정된 잠복기를 준수하는 것이 매우 중요합니다.
결론적으로, 하나의 CNS 복제에서 모든 주요 CNS 상주 세포 유형을 동시에 분리하기 위한 이 현재 프로토콜은 하나의 CNS 세포 현탁액에서 복잡한 신경 네트워크 및 신경 염증 경로를 생체 외 에서 분석할 수 있는 가능성을 제공합니다. 따라서, 중추신경계 상주 세포는 질병 과정의 여러 단계 동안, 예를 들어, 신경 염증, 신경 퇴행 및/또는 EAE의 관해 동안에 조사될 수 있습니다. 또한 세포 간 상호 작용 및 생화학적 경로를 개별 수준에서 연구할 수 있으며 실험 그룹 내의 변동성을 줄일 수 있습니다. 또한 추가 기능 분석 및 검증을 위해 단일 배양에서 분리된 CNS 세포의 분획을 배양할 수 있는 기회도 있습니다. 전체적으로 이 프로토콜은 전임상 및 임상 연구 접근 방식에 잠재적으로 영향을 미칠 수 있는 상당한 발전을 제공합니다.

다발성 경화증(MS)은 탈수초화, 축삭 손상, 신경교증 및 신경 퇴행을 특징으로 하는 중추신경계(CNS)의 만성 염증성 자가면역 질환입니다. 이 분야의 수많은 연구 접근에도 불구하고 다발성경화증의 병태생리학은 여전히 완전히 이해되지 않고있다 1,2,3,4. 다발성경화증을 조사하기 위한 가장 일반적인 동물 모델은 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질 펩타이드 35-55(MOG35-55)-유발 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)으로, 임상적 및 병태생리학적 특징을 많이 공유합니다 5,6,7,8,9 . 이는 염증, 탈수초화 및 신경 축삭 변성을 유발하는 CNS 특이적 항원에 대한 면역 체계의 반응을 기반으로 합니다. 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)은 다발성경화증에서 발견되는 신경염증 경로 및 신호 전달 캐스케이드를 조사하는 데 적합한 모델입니다.
다발성경화증에 대한 현재의 치료법은 부분적으로만 효과적이며 주로 질병의 초기 염증 단계에 초점을 맞춥니다. 그러나 다발성경화증의 신경퇴행성 성분은 장기적인 치료 접근법의 주요 과제인 것 같습니다. 따라서 자가면역 질환의 분자 및 세포 메커니즘을 포괄적으로 조사하기 위해서는 재현 가능하고 정밀한 세포 분리 프로토콜이 필요합니다. 하나의 단일 세포 유형의 분리를 위한 일부 프로토콜이 10,11,12,13,14,15 존재하더라도, 한 번에 여러 CNS 상주 세포 집단의 동시 분리에 대한 충족되지 않은 요구가 있습니다. 중추신경계 상주 세포의 분리를 위한 이전의 프로토콜은 세포 기능 및 순도를 보존하는 데 부족하여, 인접 세포와의 공동 배양 16,17,18 또는 생체 외 세포 내 네트워크의 복잡한 분석에 부적합하였다 19,20,21,22.
이 프로토콜의 목적은 성인 건강 및 EAE 마우스에 적용 가능한 모든 주요 CNS-상주 세포 유형의 순수 생존 가능한 단일 세포 현탁액의 동시 분리를 위한 재현 가능하고 포괄적인 방법을 확립하는 것이었습니다. 서로 다른 세포 유형은 자기 활성화 세포 분류(MACS)를 사용하여 분리되었습니다(23). 세포 분리는 positive selection, 즉 세포 유형별 표면 마커의 자기 표지 또는 비오틴화 및 원하지 않는 모든 세포의 고갈을 통한 negative selection에 의해 수행될 수 있습니다. 90% 이상의 순도와 분리된 단일 세포 현탁액의 최소 80%의 생존율을 보장하기 위해 유세포 분석이 적용되었습니다.
결론적으로, 주요 목표는 건강한 EAE 마우스의 복잡한 세포 네트워크 및 생화학적 신호 캐스케이드의 포괄적이고 정확한 분석을 제공하는 신경 염증 경로 조사를 위한 다목적 도구로서 모든 주요 CNS 상주 세포 유형의 동시 분리를 위한 프로토콜을 설정하는 것이었습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>70 &#956;m cell strainers</td>
			<td>Corning, MA, USA</td>
			<td>352350</td>
			<td>CNS tissue dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACSA-2 Antibody, anti-mouse, PE-Vio 615 (clone REA-969)</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td>
			<td>130-116-244</td>
			<td>Flow cytometry, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adult Brain Dissociation Kit, mouse, and rat</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td>
			<td>130-107-677</td>
			<td>Tissue dissociation,contains debris and red blood cell removal solutions; prepare aliquots of enzyme A and P upon arrival and store them at -20 &#176;C; store the remaining kit at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ACSA-2 MicroBead Kit, mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td>
			<td>130-097-678</td>
			<td>MACS of astrocytes, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD16/32 antibody&#160;</td>
			<td>BioLegend, London, UK</td>
			<td>101301</td>
			<td>Flow cytometry, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-O4 MicroBeads, human, mouse, rat</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td>
			<td>130-094-543</td>
			<td>MACS of oligodendrocytes, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AstroMACS Separation buffer</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td>MACS of astrocytes, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Antibody, PE (clone Bio3-18E7)</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td>
			<td>130-113-853</td>
			<td>Flow cytometry, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRAND Neubauer counting chamber</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td>
			<td>10195580</td>
			<td>Cell counting&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 510 anti-mouse CD45 Antibody (clone 30-F11)</td>
			<td>BioLegend, London, UK</td>
			<td>103137</td>
			<td>Flow cytometry, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b MicroBeads, human, mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td>
			<td>130-049-601</td>
			<td>MACS of microglia, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I, recombinant, Rnase-free</td>
			<td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td>
			<td>4716728001</td>
			<td>Flow cytometry, store at -20&#176; C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS with Calcium, Magnesium, Glucose, Pyruvat</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td>
			<td>14287080</td>
			<td>Buffer, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS, without calcium, without magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td>
			<td>14190250</td>
			<td>Buffer, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td>
			<td>65-0865-14</td>
			<td>Flow cytometry, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Foxp3/Transcription factor staining buffer set</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td>
			<td>00-5523-00</td>
			<td>Flow cytometry, store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon (15 mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td>
			<td>11507411</td>
			<td>Cell tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon (50 mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td>
			<td>10788561</td>
			<td>Cell tube&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon&#160;Round-Bottom Polystyrene Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap, 5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td>
			<td>08-771-23</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FcR Blocking Reagent, mouse&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td>
			<td>130-092-575</td>
			<td>MACS of oligodendrocytes, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female C57BL/6J mice</td>
			<td>Charles River Laboratories, Sulzfeld, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Active EAE induction&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td>
			<td>F2442-50ML</td>
			<td>Flow cytometry, store at -5 to -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Rat Anti-CD 11b&#160; (clone M1/70)</td>
			<td>BD Biosciences, San Jose, CA, USA</td>
			<td>553310</td>
			<td>Flow cytometry, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freund&#8217;s Complete adjuvant</td>
			<td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td>
			<td>AR001</td>
			<td>Active EAE induction, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GentleMACS C Tubes</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td>
			<td>130-093-237</td>
			<td>CNS tissue dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GentleMACS Octo Dissociator with Heaters</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td>
			<td>130-096-427</td>
			<td>CNS tissue dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 8.4.3</td>
			<td>Graphpad by Dotmatics</td>
			<td></td>
			<td>Graphical Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>AbbVie, North Chicago, IL, USA</td>
			<td></td>
			<td>Active EAE induction, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaluza Analysis Software V2.1.1</td>
			<td>Beckman Coulter, Indianapolis, IN, USA</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>MACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS BSA Stock Solution</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td>PB-buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td>MACS&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOG35&#8211;55 peptide</td>
			<td>Charit&#233;, Berlin, Germany; alternatives: Genosphere Biotechnologies (Paris, France) or sb-Peptide (Saint Egr&#232;ve, France)</td>
			<td></td>
			<td>Active EAE induction, store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium tuberculosis strain H37 Ra</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company (BD),Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td></td>
			<td>Active EAE induction, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuron Isolation Kit, mouse&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td>
			<td>130-115-390</td>
			<td>MACS of neurons, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O4 Antibody, anti-human/mouse/rat, APC, (clone REA-576)</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td>
			<td>130-119-897</td>
			<td>Flow cytometry, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pertussis toxin in glycerol</td>
			<td>Hooke Laboratories Inc., Lawrence, MA, USA</td>
			<td>BT-0105</td>
			<td>Active EAE induction; store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pluriStrainer Mini 100 &#956;m&#160;</td>
			<td>pluriSelect Life Science UG, Leipzig, Sachsen, Germany</td>
			<td>43-10100-40</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS Separator&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td>MACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Alexa Fluor 647 Anti-NeuN antibody (clone EPR12763)</td>
			<td>Abcam, Cambridge, UK</td>
			<td>EPR12763</td>
			<td>Flow cytometry, store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Brain Matrices, 1 mm</td>
			<td>Ted Pella, Redding, CA, USA</td>
			<td>15067</td>
			<td>CNS tissue dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution, 0.4%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td>
			<td>15250061</td>
			<td>Cell counting&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5&#160;M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td>
			<td>15575020</td>
			<td>Flow cytometry, store at room temperature</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous isolation of principal central nervous system-resident cell types from adult autoimmune encephalomyelitis mice

실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)은 다발성 경화증(MS)에 대한 가장 흔한 쥐 모델이며 새로운 치료 전략을 개발하기 위해 아직 알려지지 않은 다발성경화증의 원인을 추가로 설명하는 데 자주 사용됩니다. 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질 펩타이드 35-55(MOG35-55) EAE 모델은 면역 후 10일 이내에 상행 마비와 함께 자가 제한 단상 질환 경과를 재현합니다. 생쥐는 임상 점수 시스템을 사용하여 매일 검사됩니다. 다발성경화증은 특정 시간적 패턴을 가진 다양한 병리기전에 의해 유발되므로 질병 진행 중 중추신경계(CNS)에 상주하는 세포 유형의 역할에 대한 연구는 매우 중요합니다. 이 프로토콜의 독특한 특징은 성체 EAE 및 건강한 마우스에 적용할 수 있는 모든 주요 CNS 상주 세포 유형(미세아교세포, 희소돌기아교세포, 성상교세포 및 뉴런)을 동시에 분리하는 것입니다. 성체 쥐에서 뇌와 척수를 분리한 후 자기 활성화 세포 분류(MACS)를 통해 미세아교세포, 희소돌기아교세포, 성상교세포, 뉴런을 분리합니다. 유세포 분석은 정제된 단일 세포 현탁액의 품질 분석을 수행하는 데 사용되었으며, 세포 분리 후 생존력을 확인하고 각 세포 유형의 순도를 약 90%로 표시했습니다. 결론적으로, 이 프로토콜은 건강한 마우스와 EAE 마우스의 복잡한 세포 네트워크를 분석하는 정확하고 포괄적인 방법을 제공합니다. 더욱이, 필요한 마우스 수는 4가지 세포 유형 모두가 동일한 마우스로부터 분리되기 때문에 실질적으로 감소될 수 있다.

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory autoimmune disease of the central nervous system (CNS) characterized by demyelination, axonal damage, gliosis, and neurodegeneration. Despite numerous research approaches in this field, the pathophysiology of MS is still not fully understood1,2,3,4. The most common animal model for investigating MS is the myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide 35-55 (MOG35-55)-induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) which shares many of its clinical and pathophysiological features5,6,7,8,9. It is based on the response of the immune system against CNS-specific antigens leading to inflammation, demyelination, and neuroaxonal degeneration. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is a suitable model for the investigation of neuroinflammatory pathways and signaling cascades found in MS.
Current therapy options for MS are only partially effective and focus primarily on the initial inflammatory phase of the disease. However, the neurodegenerative component of MS seems to be the major challenge for long-term therapeutic approaches. Therefore, reproducible, and precise cell isolation protocols are required to investigate molecular and cellular mechanisms in autoimmune diseases in a comprehensive way. Even if some protocols for the isolation of one single cell type exist10,11,12,13,14,15, there is an unmet need for the simultaneous isolation of several CNS-resident cell populations at once. Previous protocols for the isolation of CNS-resident cells lack in preserving cellular functionality and purity, resulting in co-cultivation with neighboring cells16,17,18 or the unsuitability for complex analyses of intracellular networks ex vivo19,20,21,22.
The aim of this protocol was to establish a reproducible and comprehensive method for the simultaneous isolation of pure viable single-cell suspensions of all principal CNS-resident cell types applicable in adult healthy and EAE mice. The different cell types were isolated using magnetic-activated cell sorting (MACS)23. The cell separation can be accomplished either by positive selection, i.e., magnetic labeling of cell-type-specific surface markers, or by negative selection via biotinylation and depletion of all undesired cells. Flow cytometry was applied to ensure a purity of above 90% and a viability of at least 80% of the isolated single-cell suspensions.
In conclusion, the main goal was to establish a protocol for the simultaneous isolation of all main CNS-resident cell types as a versatile tool for the investigation of neuroinflammatory pathways offering a comprehensive and precise analysis of complex cellular networks and biochemical signaling cascades in healthy and EAE mice.

저자 스포트라이트: 모든 주요 CNS 상주 세포 유형의 동시 분리를 통한 신경염증 경로 연구 

성인 자가면역 뇌척수염 마우스에서 주요 중추 신경계 상주 세포 유형의 동시 분리

To investigate molecular and cellular mechanisms in autoimmune diseases such as multiple sclerosis, the generation of reproducible and sophisticated cell isolation protocols is an unmet need. Most of the current technologies to isolate and analyze CNS-resident cells show serious shortcomings, such as focusing on only one cell type or only postnatal mice. The current protocol for the simultaneous isolation of all main CNS-resident cell types from one CNS replicate offers the possibility to analyze complex neuronal networks and new inflammatory pathways, ex vivo from one single cell suspension, applicable to healthy mice and those with experimental autoimmune encephalomyelitis.Additionally, mice numbers are decreased Our protocol for the simultaneous isolation of all four major CNS-resident cell types in healthy and EAE mice could be used as a helpful tool for research groups studying new inflammatory pathways, allowing a much more accurate analysis of complex biomolecular mechanisms and cellular networks ex vivo. New scientific questions that could be answered with the help of our protocol are dynamic investigations in EAE during different stages of disease course, like neuroinflammation, neurodegeneration, and remission. Also, cell-cell interactions and biochemical pathways could be studied on an individual level.Likewise, functional assays could be performed with cultivated cells. We intend to focus on dynamic studies of the EAE course for multi-omic analysis from one individual CNS homogenate per EAE time point.

현재 프로토콜은 모든 주요 중추신경계 상주 세포, 즉 미세아교세포, 희소돌기아교세포, 성상교세포 및 뉴런을 하나의 단일 중추신경계 복제에서 동시에 분리할 수 있는 가능성을 제공합니다. 이는 이러한 종류의 실험에 필요한 마우스 수를 줄이고 세포 수준에서 분자 및 생화학 분석의 비교 가능성을 보장하는 데 중요합니다. 개별 세포 유형이 서로 다른 CNS 복제에서 분리되는 경우 세포 상호 작용을 진실하게 매핑할 수 없으며 분리 프로세스 중 잠재적인 기술적 편차로 인해 추가 다운스트림 분석이 편향될 수 있습니다. 더하여, 각 세포 유형에서 분자와 생화확적인 발견은 동일한 EAE 문맥에서 파생되지 않기 때문에 서로 비교되지 않을 것입니다. 상용 시스템/키트를 사용하는 기존 MACS 프로토콜은 위에서 언급한 세포 유형의 동시 분리를 가능하게 하도록 조정되었습니다.
미세아교세포의 분리는 anti-CD11b micro-beads를 이용하여 수행하였고, oligodendrocyte는 anti-O4 micro-beads를 통해 분리하였으며(표 1), astrocyte를 분리하기 위하여 anti-ACSA-2 micro-beads를 사용하였다(Table 2). 대조적으로, 뉴런의 분리는 negative selection을 나타내며 모든 non-neuronal cell의 biotinylation 및 magnetic labeling에 의해 달성되었습니다(표 2). 혈액 세포를 제외한 모든 비신경 세포(예: 희소돌기아교세포, 미세아교세포, 성상교세포, 내피세포 및 섬유아세포)는 이러한 비신경 세포에서 발현되는 표면 항원에 대해 특이적으로 지시되는 비오틴-접합 항체를 사용하여 자기적으로 표지할 수 있습니다(표 2). 이러한 자기적으로 표지된 비신경 세포의 고갈에 의해, 매우 순수하고 생존 가능한 신경 세포 집단은 30,42,43을 생성할 수 있습니다.
생성된 단일 세포 현탁액의 순도 분석을 위한 두 개의 새로운 유세포 분석 패널이 설계되었습니다. 여기서는 세포 유형별 표면 및 핵 마커와 살아있는/죽은 세포 구별을 결합했습니다.
그 결과 생쥐 및 세포 유형(그림 3A)당 세포 수율을 분석한 결과 평균 8이 나왔습니다. 4 x 105 ± 3 x 104 미세아교세포, 3.23 x 106 ± 1 x 105 희소돌기아교세포, 8.6 x 105 ± 2 x 104 성상교세포, 4.5 x 105 ± 1 x 104 뉴런.
neuroinflammation의 질병 모형을 조사하는 목표의 문맥에서는, 의정서는 EAE의 쥐 모형에 또한 적용되었습니다. 마우스는 EAE 유도 후 16 일째에 질병 최대치를 나타내는 안락사되었습니다. 이 EAE 설정에서, 대략 2.9 x 106 ± 6.7 x 105 희소돌기아교세포, 5.2 x 105 ± 9 x 104 성상교세포 및 4.4 x 105 ± 4 x 104 뉴런을 분리하였다. 미세아교세포 수율은 MACS 단계 후 추가 세포 분류로 인해 EAE 마우스당 약 1.7 x 105 ± 4 x 104 미세아교세포로 감소했습니다(그림 3A).
분리 후, 유세포 분석을 통해 다양한 세포 집단의 표현형 특성 분석을 통해 모든 주요 CNS 상주 세포 유형에 대해 약 90%의 순도를 가진 생존 가능한 단일 세포 현탁액을 달성할 수 있음을 입증했습니다(그림 3B). 미세아교세포는 문헌44,45,46,47에 정의된 바와 같이CD45 intCD11b 높이인 것으로 게이트되었다.
EAE에서는, microglia는 neuroinflammation 27,28,48 도중 중추신경계로 이동하는 단핵구, 호중구, 자연살해세포, 과립구 및 대식세포와 같은 다른 CD11b+ 면역 세포에서 그(것)들을 분화하기 위하여 모든 CD11b+ 세포에서 분류되어야 했습니다. 따라서, 미세아교세포는 CD11b+ 세포 현탁액으로부터 CD45intCD11high cell로 분류되었습니다. 전체 미세아교세포 분류 전략은 그림 4에 나와 있습니다. 순진한 마우스에서 미세아교세포 집단은 모든 살아있는 단일 세포의 91.16%(전체 CD11b+ 집단의 96%)였습니다(그림 4A). EAE 마우스에서 미세아교세포 집단은 모든 살아있는 단일 세포의 46.85%(전체 CD11b+ 집단의 55%)였습니다(그림 4B). MACS 및 FACS 절차 모두 단일 세포에 기계적 응력을 가하지만, 분류된 정제된 미세아교세포의 75.41% ± 8.63%가 생존 가능했습니다(그림 3B).
초기 중추신경계 세포 현탁액에서 직접 분리된 성상교세포와 뉴런은 희소돌기아교세포와 관련된 오염을 보였으며, 이는 희소돌기아교세포의 음성 흐름으로부터 뉴런과 성상교세포를 동시에 분리하면 이러한 오염을 방지할 수 있다는 가정으로 이어졌습니다. 유세포 분석 결과 희소돌기아교세포의 음성 유동에서 분리된 성상교세포는 순도 89.23% ± 2.78%를 가지며 80.56% ± 1.41%의 생존율을 보였습니다. 이러한 결과와 유사하게, O4 세포 분획에서 분리된 뉴런의 순도는 81.25% ± 3.31%였고, 생존율은 83.90% ± 2.61%였습니다(그림 3B). 이러한 발견은 또한 희소돌기아교세포의 분리에 뒤이어 이 두 세포 유형의 동시 분리가 생존 가능한 기능성 세포의 양에 영향을 미치지 않는다는 것을 확인합니다.
분리된 단세포 현탁액의 생존력 및 순도에 관한 결과는 순진한 마우스에서 받은 결과와 비교하여 EAE 마우스에서 매우 유사했으며, 이는 이 프로토콜이 EAE의 맥락뿐만 아니라 건강한 마우스에 적합하다는 것을 확인했습니다(그림 3B).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65735/65735fig03.jpg"> 그림 3: 분리된 CNS 상주 세포의 세포 수율 및 유세포 분석 기반 검증. (A) naive 및 EAE 마우스에서 CNS 상주 세포를 분리한 후 마우스 및 세포 유형당 세포 수율. 막대 그래프는 제시된 프로토콜의 구현 후 마우스 및 세포 유형당 세포 수율의 양을 시각화합니다. 순진한 마우스에서 결과를 위해 5개의 생물학적 복제물을 처리하고, EAE 마우스에서 4개의 생물학적 복제물을 분석했습니다. SEM± 각각의 수단이 표시됩니다. (B) 정제된 세포 분획의 해당 순도 및 생존도 분석. 막대 그래프는 세포 유형별 마커의 발현을 기반으로 생성된 단일 세포 현탁액의 생존력과 순도를 나타냅니다. NeuN은 뉴런에 대한 세포 유형 특이적 핵 마커로 사용되었습니다. 5개의 생물학적 복제물을 획득하여 건강한 마우스와 EAE 마우스 모두에 대해 각 세포 유형에 대해 비교했습니다. SEM± 각각의 수단이 표시됩니다. 약어: 항-ACSA-2 = 성상교세포 세포 표면 항원-2; CD11b = 사이클린 의존성 키나아제 11B; CD45 = 수용체형 티로신-단백질 인산가수분해효소 C; CNS = 중추 신경계; EAE = 실험적 자가면역 뇌척수염; MACS = 자기 활성화 세포 분류; NeuN = RNA 결합 단백질 fox-1 상동체 3; O4 = 희소돌기아교세포 마커 O4; SEM = 평균의 표준 오차. 이 수치는49에서 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65735/65735fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65735/65735fig04.jpg"> 그림 4: CD11b+ 세포 분리 후 미세아교세포의 세포 분류를 위한 게이팅 전략. (A) 순진한 및 (B) EAE 마우스의 게이팅 전략. 각 패널의 위쪽 행에는 정렬 전의 점도표가 표시되고 정렬 후의 아래쪽 행에는 점도표가 표시됩니다. 생세포(SSC-A/FSC-A) 및 단일세포(FCS-H/FSC-W)를 선택한 후, CD45intCD11b+ 세포의 집단을 미세아교세포(microglia) 집단으로 분류하였다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65735/65735fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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현재까지 동일한 마우스에서 모든 주요 중추 신경계 상주 세포 유형을 동시에 분리하기 위한 프로토콜은 충족되지 않은 수요입니다. 이 프로토콜은 신경 염증 중에 복잡한 세포 네트워크를 조사하고 동시에 필요한 마우스 수를 줄이기 위해 순진하고 실험적인 자가면역 뇌척수염 마우스에 적용할 수 있는 절차를 보여줍니다.

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is the most common murine model for multiple sclerosis (MS) and is frequently used to further elucidate ...

다발성 경화증과 같은 자가면역 질환의 분자 및 세포 메커니즘을 조사하기 위해서는 재현 가능하고 정교한 세포 분리 프로토콜의 생성이 충족되지 않은 요구입니다. CNS에 상주하는 세포를 분리하고 분석하는 현재 기술의 대부분은 한 가지 세포 유형에만 초점을 맞추거나 출생 후 마우스에만 초점을 맞추는 등 심각한 단점을 보입니다. 하나의 CNS 복제에서 모든 주요 CNS 상주 세포 유형을 동시에 분리하기 위한 현재 프로토콜은 건강한 마우스와 실험적 자가면역 뇌척수염 환자에게 적용할 수 있는 복잡한 신경 네트워크와 새로운 염증 경로(생체 외)를 하나의 단일 세포 현탁액에서 분석할 수 있는 가능성을 제공합니다.또한, 생쥐 수가 감소합니다 건강한 생쥐와 EAE 생쥐에서 4가지 주요 CNS 상주 세포 유형을 모두 동시에 분리하기 위한 당사의 프로토콜은 새로운 염증 경로를 연구하는 연구 그룹에 유용한 도구로 사용될 수 있어 생체 외 복잡한 생체 분자 메커니즘 및 세포 네트워크를 훨씬 더 정확하게 분석할 수 있습니다. 우리의 의정서의 도움으로 응답될 수 있던 새로운 과학적인 질문은 neuroinflammation, neurodegeneration 및 관해 같이 질병 과정의 다른 단계 도중 EAE에 있는 동적인 수사입니다. 또한 세포 간 상호 작용 및 생화학적 경로를 개별 수준에서 연구할 수 있습니다.마찬가지로, 배양된 세포로 기능적 분석을 수행할 수 있습니다. 우리는 EAE 시점당 하나의 개별 CNS 균질액에서 다중 오믹 분석을 위한 EAE 과정의 동적 연구에 중점을 둘 계획입니다.

성인 자가면역 뇌척수염 마우스에서 주요 중추 신경계 상주 세포 유형의 동시 분리

Abstract