Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פיתחנו מתודולוגיה להערכה אם גידולים במערכת העצבים בעכברים מהונדסים גנטית משחזרים במדויק את הפתולוגיה של עמיתיהם האנושיים. כאן, אנו מיישמים טכניקות היסטולוגיות אלה, קריטריונים פתולוגיים מוגדרים ומתודולוגיות תרבית על נוירופיברומות וגידולים ממאירים במעטפת העצבים ההיקפית הנובעים במודל העכבר P 0-GGFβ3.

Abstract

חולים עם תסמונת רגישות הגידול האוטוזומלית הדומיננטית נוירופיברומטוזיס מסוג 1 (NF1) מפתחים בדרך כלל נוירופיברומות פרספקס (PNs) שלאחר מכן הופכות לגידולי מעטפת עצב היקפיים אגרסיביים ביותר (MPNST). הבנת התהליך שבו נוירופתיה היקפית הופכת ל-MPNST תתאפשר הודות לזמינותם של מודלים של עכברים מהונדסים גנטית (GEM) המשחזרים במדויק את התקדמות PN-MPNST שנצפתה בבני אדם עם NF1. למרבה הצער, דגמי GEM עם אבלציה Nf1 אינם משחזרים תהליך זה במלואו. זה הוביל אותנו לפתח עכברי P 0-GGFβ3, מודל GEM שבו ביטוי יתר של מיטוגן תאי Schwann neuregulin-1 (NRG1) בתאי Schwann גורם להתפתחות של PNs המתקדמים להיות MPNST בתדירות גבוהה. עם זאת, כדי לקבוע אם גידולים והתקדמות ניאופלסטית בעכברי P 0-GGFβ3 מדגימים במדויק את התהליכים שנצפו בחולי NF1, היינו צריכים להוכיח תחילה שהפתולוגיה של גידולי מעטפת העצבים ההיקפיים P0-GGFβ3 משחזרת את הפתולוגיה של עמיתיהם האנושיים.

כאן, אנו מתארים את המתודולוגיות המיוחדות המשמשות לאבחון מדויק ולציון גידולים במערכת העצבים ההיקפית במודלים של GEM, באמצעות P 0-GGFβ3 ו- P0-GGFβ3; Trp53+/- עכברים כדוגמה. אנו מתארים את השיטות ההיסטולוגיות, האימונוהיסטוכימיות וההיסטוכימיות המשמשות לאבחון PNs ו- MPNSTs, כיצד להבחין בין גידולים אלה לבין סוגי גידולים אחרים המחקים את הפתולוגיה שלהם, וכיצד לדרג גידולים אלה. אנו דנים בהקמת תרביות מעבר מוקדמות מ- GEM MPNSTs, כיצד לאפיין תרבויות אלה באמצעות אימונוציטוכימיה, וכיצד לאמת את הגידול שלהן על ידי הקמת allografts. באופן קולקטיבי, טכניקות אלה מאפיינות את הפתולוגיה של PNs ו- MPNST המתעוררים במודלים של GEM ומשווים באופן ביקורתי את הפתולוגיה של גידולים מורינים אלה לעמיתיהם האנושיים.

Introduction

במהלך שלושת העשורים האחרונים, מעבדות רבות ניסו ליצור מודלים עכבריים של סרטן אנושי על ידי החדרת מוטציות הקשורות לסרטן אנושי לתוך הגנום של העכבר או על ידי ביטוי יתר של תוצר גנטי המתבטא יתר על המידה בסרטן אנושי. המודלים המתקבלים של עכבר מהונדס גנטית (GEM) יכולים לשמש למגוון מטרות, כגון קביעה כי השינוי הגנומי החדש שהוכנס יוזם גידול, זיהוי שינויים גנטיים או אפיגנטיים אחרים המתרחשים לאחר מכן התורמים להתקדמות הגידול, והגדרת מסלולי האיתות העיקריים המניעים את התחלת הגידול והתקדמותו. שלא כמו מודלים אורתוטופיים של קסנוגרפט, המסתמכים על שימוש בעכברים מדוכאי חיסון, למודלים של סרטן GEM יש מערכת חיסונית מתפקדת במלואה ולכן מודל מדויק יותר של תגובות לחומרים טיפוליים מועמדים. עם זאת, ב....

Protocol

הנהלים המתוארים כאן אושרו על ידי IACUC של האוניברסיטה הרפואית של דרום קרוליינה ובוצעו על ידי אנשי צוות מאומנים כראוי בהתאם למדריך NIH לטיפול ושימוש בחיות מעבדה והנחיות הטיפול בבעלי חיים מוסדיים של MUSC.

1. קביעת חדירת הגידול והישרדותו בעכברי P 0-GGFβ3 וזיהוי גידולים בבעלי חיים אל.......

Representative Results

איור 2 מדגים דוגמאות של גידולים ברורים לחלוטין המתעוררים בעכברי P 0-GGFβ3. גידולים שניתן לזהות בקלות בעין בלתי עשויים להיראות כגושים המפרידים בין אזורי גוף, כפי שמוצג באיור 2A (חץ). כאשר קובעים אם הניאופלזמה היא פוטנציאל לגידול נדן עצב היקפי, חיוני לקבוע כ?.......

Discussion

השיטות ההיסטולוגיות והביוכימיות המוצגות כאן מספקות מסגרת לאבחון ואפיון מודלים של GEM של פתוגנזה נוירופיברומה ו- MPNST. במהלך השנים, מצאנו מתודולוגיות אלה להיות שימושי למדי להערכת הפתולוגיה של גידולים עצביים היקפיים הנובעים מודלים GEM 21,25,26. ע.......

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכון הלאומי למחלות נוירולוגיות ושבץ (R01 NS048353 ו- R01 NS109655 ל- S.L.C.; R01 NS109655-03S1 ל- D.P.J.), המכון הלאומי לסרטן (R01 CA122804 ל- S.L.C.) ומשרד ההגנה (X81XWH-09-1-0086 ו- W81XWH-12-1-0164 ל- S.L.C).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
100 mm Tissue Culture PlatesCorning Falcon353003
3, 3'- Diaminobensidine (DAB)Vector LaboratoriesSK-400
6- well platesCorning Costar3516
Acetic AcidFisher ScientificA38-212
Alexa Fluor 488 Secondary (Goat Anti-Mouse)InvitrogenA11029
Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Mouse)InvitrogenA21043 or A11004
Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Rabbit)InvitrogenA11036
Ammonium Chloride (NH4Cl)Fisher ScientificA661-500
BCA Protein Assay KitThermo Scientific23225
Bovine Serum AlbuminFisher ScientificBP1600-100
CaldesmonABCAM E89, ab32330
CD117Cell Marque117R-18-ASR
CD163LeicaNCL-L-CD163
CD31ABCAM ab29364
CD34ABCAM ab81289
CD86ABCAM ab53004
Cell ScraperSarstedt83.183
Cell StripperCorning25-056-CI
Circle CoverslipFisher Scientific12-545-100
Citrisolve Hybrid (d-limonene-based solvent)Decon Laboratories5989-27-5
Critic AcidFisher ScientificA104-500
CytokeratinABCAM C-11, ab7753
DesminAgilent Dako clone D33 (M0760)
Diaminobensizdine (DAB) SolutionVector LaboratoriesSK-4100
DMEMCorning15-013-CV
Eosin YThermo Scientific7111
Ethanol (200 Proof)Decon Laboratories2716
Fetal Calf SerumOmega ScientificFB-01
ForksolinSigma-AldrichF6886
GlycerolSigma-AldrichG6279
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)Corning21-022-CV
Harris HematoxylinFisherbrand245-677
HemacytometerBrightline-Hauser Scientific1490
Hydrochloric AcidFisher ScientificA144-212
Hydrogen PeroxideFisher Scientific327-500
Iba1Wako Chemicals019-19741
ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit ,Mouse on MouseVector LaboratoriesMP-2400
ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit, Horse Anti-RabbitVector LaboratoriesMP-7401
IncubatorThermo ScientificHeracell 240i CO2 incubator
IsofluranePiramalNDC 66794-017-25
IsopropanolFisher ScientificA415
Ki-67Cell Signaling 12202
LamininThermo Fisher Scientific23017015
Liquid Nitrogen
MART1ABCAM M2-9E3, ab187369
Microtome
NestinMillipore Human: MAD5236 (10C2), Human:MAB353 (Rat-401)
Neuregulin 1 betaIn houseMade by S.L.C. (also available as 396-HB-050/CF from R&D Systems)
NeurofibrominSanta Cruz Biotechnology sc-67
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ miceJackson Laboratory5557
Nonfat Dry MilkWalmartGreat Value Brand
P0-GGFβ3 miceIn house
Paraffin WaxLeicaParaplast 39601006
Parafilm MSigma-AldrichPM-999
Paraformaldehyde (4%)Thermo ScientificJ19943-K2
Permount (Xylene Mounting Medium)Fisher ScientificSP15-100
pH MeterMettler ToldedoSeven Excellence, 8603
Phosphate Buffered Saline (Dulbecco's)Corning20-031-CV
PMELABCAM EP4863(2), ab137078
Poly-L-Lysine HydrobromideSigma-AldrichP5899-5MG
Portable Isoflurance MachineVetEquip Inhalation Anesthesia Systems
PVA-DABCO (Aqueous Mounting Medium)Millipore Sigma10981100ML
Rice CookerBeech Hamilton
S100BAgilent Dako Z0311  (now GA504)
SMAVentana Medical Systems clone 1A4
Sodium ChlorideFisher ScientificS640
Sodium Citrate (Dihydrate)Fisher ScientificBP327-1
Sox10ABCAM ab212843
Steel histology mold
Superfrost Plus Microscope SlidesFisher Scientific12-550-15
TCF4/TCFL2 Cell Signaling (CH48H11) #2569
Tissue Cassette
Toluidine BlueACROS Organics348600050
Triton X-100Fisher ScientificBP151-500
TRIzolInvitrogen15596026
TrypsinCorning25-051-31

References

  1. Carroll, S. L. Molecular mechanisms promoting the pathogenesis of Schwann cell neoplasms. Acta Neuropathologica. 123 (3), 321-348 (2012).
  2. Longo, J. F., Weber, S. M., Turner-Ivey, B. P., Carroll, S. L.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE207

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved