A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
זיהוי, אבחון ודירוג גידולי מעטפת עצב היקפיים ממאירים במודלים של עכברים מהונדסים גנטית
In This Article
Summary
פיתחנו מתודולוגיה להערכה אם גידולים במערכת העצבים בעכברים מהונדסים גנטית משחזרים במדויק את הפתולוגיה של עמיתיהם האנושיים. כאן, אנו מיישמים טכניקות היסטולוגיות אלה, קריטריונים פתולוגיים מוגדרים ומתודולוגיות תרבית על נוירופיברומות וגידולים ממאירים במעטפת העצבים ההיקפית הנובעים במודל העכבר P 0-GGFβ3.
Abstract
חולים עם תסמונת רגישות הגידול האוטוזומלית הדומיננטית נוירופיברומטוזיס מסוג 1 (NF1) מפתחים בדרך כלל נוירופיברומות פרספקס (PNs) שלאחר מכן הופכות לגידולי מעטפת עצב היקפיים אגרסיביים ביותר (MPNST). הבנת התהליך שבו נוירופתיה היקפית הופכת ל-MPNST תתאפשר הודות לזמינותם של מודלים של עכברים מהונדסים גנטית (GEM) המשחזרים במדויק את התקדמות PN-MPNST שנצפתה בבני אדם עם NF1. למרבה הצער, דגמי GEM עם אבלציה Nf1 אינם משחזרים תהליך זה במלואו. זה הוביל אותנו לפתח עכברי P 0-GGFβ3, מודל GEM שבו ביטוי יתר של מיטוגן תאי Schwann neuregulin-1 (NRG1) בתאי Schwann גורם להתפתחות של PNs המתקדמים להיות MPNST בתדירות גבוהה. עם זאת, כדי לקבוע אם גידולים והתקדמות ניאופלסטית בעכברי P 0-GGFβ3 מדגימים במדויק את התהליכים שנצפו בחולי NF1, היינו צריכים להוכיח תחילה שהפתולוגיה של גידולי מעטפת העצבים ההיקפיים P0-GGFβ3 משחזרת את הפתולוגיה של עמיתיהם האנושיים.
כאן, אנו מתארים את המתודולוגיות המיוחדות המשמשות לאבחון מדויק ולציון גידולים במערכת העצבים ההיקפית במודלים של GEM, באמצעות P 0-GGFβ3 ו- P0-GGFβ3; Trp53+/- עכברים כדוגמה. אנו מתארים את השיטות ההיסטולוגיות, האימונוהיסטוכימיות וההיסטוכימיות המשמשות לאבחון PNs ו- MPNSTs, כיצד להבחין בין גידולים אלה לבין סוגי גידולים אחרים המחקים את הפתולוגיה שלהם, וכיצד לדרג גידולים אלה. אנו דנים בהקמת תרביות מעבר מוקדמות מ- GEM MPNSTs, כיצד לאפיין תרבויות אלה באמצעות אימונוציטוכימיה, וכיצד לאמת את הגידול שלהן על ידי הקמת allografts. באופן קולקטיבי, טכניקות אלה מאפיינות את הפתולוגיה של PNs ו- MPNST המתעוררים במודלים של GEM ומשווים באופן ביקורתי את הפתולוגיה של גידולים מורינים אלה לעמיתיהם האנושיים.
Introduction
במהלך שלושת העשורים האחרונים, מעבדות רבות ניסו ליצור מודלים עכבריים של סרטן אנושי על ידי החדרת מוטציות הקשורות לסרטן אנושי לתוך הגנום של העכבר או על ידי ביטוי יתר של תוצר גנטי המתבטא יתר על המידה בסרטן אנושי. המודלים המתקבלים של עכבר מהונדס גנטית (GEM) יכולים לשמש למגוון מטרות, כגון קביעה כי השינוי הגנומי החדש שהוכנס יוזם גידול, זיהוי שינויים גנטיים או אפיגנטיים אחרים המתרחשים לאחר מכן התורמים להתקדמות הגידול, והגדרת מסלולי האיתות העיקריים המניעים את התחלת הגידול והתקדמותו. שלא כמו מודלים אורתוטופיים של קסנוגרפט, המסתמכים על שימוש בעכברים מדוכאי חיסון, למודלים של סרטן GEM יש מערכת חיסונית מתפקדת במלואה ולכן מודל מדויק יותר של תגובות לחומרים טיפוליים מועמדים. עם זאת, ב....
Protocol
הנהלים המתוארים כאן אושרו על ידי IACUC של האוניברסיטה הרפואית של דרום קרוליינה ובוצעו על ידי אנשי צוות מאומנים כראוי בהתאם למדריך NIH לטיפול ושימוש בחיות מעבדה והנחיות הטיפול בבעלי חיים מוסדיים של MUSC.
1. קביעת חדירת הגידול והישרדותו בעכברי P 0-GGFβ3 וזיהוי גידולים בבעלי חיים אל.......
Representative Results
איור 2 מדגים דוגמאות של גידולים ברורים לחלוטין המתעוררים בעכברי P 0-GGFβ3. גידולים שניתן לזהות בקלות בעין בלתי עשויים להיראות כגושים המפרידים בין אזורי גוף, כפי שמוצג באיור 2A (חץ). כאשר קובעים אם הניאופלזמה היא פוטנציאל לגידול נדן עצב היקפי, חיוני לקבוע כ?.......
Discussion
השיטות ההיסטולוגיות והביוכימיות המוצגות כאן מספקות מסגרת לאבחון ואפיון מודלים של GEM של פתוגנזה נוירופיברומה ו- MPNST. במהלך השנים, מצאנו מתודולוגיות אלה להיות שימושי למדי להערכת הפתולוגיה של גידולים עצביים היקפיים הנובעים מודלים GEM 21,25,26. ע.......
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכון הלאומי למחלות נוירולוגיות ושבץ (R01 NS048353 ו- R01 NS109655 ל- S.L.C.; R01 NS109655-03S1 ל- D.P.J.), המכון הלאומי לסרטן (R01 CA122804 ל- S.L.C.) ומשרד ההגנה (X81XWH-09-1-0086 ו- W81XWH-12-1-0164 ל- S.L.C).
....Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm Tissue Culture Plates | Corning Falcon | 353003 | |
| 3, 3'- Diaminobensidine (DAB) | Vector Laboratories | SK-400 | |
| 6- well plates | Corning Costar | 3516 | |
| Acetic Acid | Fisher Scientific | A38-212 | |
| Alexa Fluor 488 Secondary (Goat Anti-Mouse) | Invitrogen | A11029 | |
| Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Mouse) | Invitrogen | A21043 or A11004 | |
| Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Rabbit) | Invitrogen | A11036 | |
| Ammonium Chloride (NH4Cl) | Fisher Scientific | A661-500 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Caldesmon | ABCAM | E89, ab32330 | |
| CD117 | Cell Marque | 117R-18-ASR | |
| CD163 | Leica | NCL-L-CD163 | |
| CD31 | ABCAM | ab29364 | |
| CD34 | ABCAM | ab81289 | |
| CD86 | ABCAM | ab53004 | |
| Cell Scraper | Sarstedt | 83.183 | |
| Cell Stripper | Corning | 25-056-CI | |
| Circle Coverslip | Fisher Scientific | 12-545-100 | |
| Citrisolve Hybrid (d-limonene-based solvent) | Decon Laboratories | 5989-27-5 | |
| Critic Acid | Fisher Scientific | A104-500 | |
| Cytokeratin | ABCAM | C-11, ab7753 | |
| Desmin | Agilent Dako | clone D33 (M0760) | |
| Diaminobensizdine (DAB) Solution | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| DMEM | Corning | 15-013-CV | |
| Eosin Y | Thermo Scientific | 7111 | |
| Ethanol (200 Proof) | Decon Laboratories | 2716 | |
| Fetal Calf Serum | Omega Scientific | FB-01 | |
| Forksolin | Sigma-Aldrich | F6886 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G6279 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | 21-022-CV | |
| Harris Hematoxylin | Fisherbrand | 245-677 | |
| Hemacytometer | Brightline-Hauser Scientific | 1490 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-212 | |
| Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | 327-500 | |
| Iba1 | Wako Chemicals | 019-19741 | |
| ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit ,Mouse on Mouse | Vector Laboratories | MP-2400 | |
| ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit, Horse Anti-Rabbit | Vector Laboratories | MP-7401 | |
| Incubator | Thermo Scientific | Heracell 240i CO2 incubator | |
| Isoflurane | Piramal | NDC 66794-017-25 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A415 | |
| Ki-67 | Cell Signaling | 12202 | |
| Laminin | Thermo Fisher Scientific | 23017015 | |
| Liquid Nitrogen | |||
| MART1 | ABCAM | M2-9E3, ab187369 | |
| Microtome | |||
| Nestin | Millipore | Human: MAD5236 (10C2), Human:MAB353 (Rat-401) | |
| Neuregulin 1 beta | In house | Made by S.L.C. (also available as 396-HB-050/CF from R&D Systems) | |
| Neurofibromin | Santa Cruz Biotechnology | sc-67 | |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ mice | Jackson Laboratory | 5557 | |
| Nonfat Dry Milk | Walmart | Great Value Brand | |
| P0-GGFβ3 mice | In house | ||
| Paraffin Wax | Leica | Paraplast 39601006 | |
| Parafilm M | Sigma-Aldrich | PM-999 | |
| Paraformaldehyde (4%) | Thermo Scientific | J19943-K2 | |
| Permount (Xylene Mounting Medium) | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| pH Meter | Mettler Toldedo | Seven Excellence, 8603 | |
| Phosphate Buffered Saline (Dulbecco's) | Corning | 20-031-CV | |
| PMEL | ABCAM | EP4863(2), ab137078 | |
| Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P5899-5MG | |
| Portable Isoflurance Machine | VetEquip Inhalation Anesthesia Systems | ||
| PVA-DABCO (Aqueous Mounting Medium) | Millipore Sigma | 10981100ML | |
| Rice Cooker | Beech Hamilton | ||
| S100B | Agilent Dako | Z0311 (now GA504) | |
| SMA | Ventana Medical Systems | clone 1A4 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S640 | |
| Sodium Citrate (Dihydrate) | Fisher Scientific | BP327-1 | |
| Sox10 | ABCAM | ab212843 | |
| Steel histology mold | |||
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| TCF4/TCFL2 | Cell Signaling | (CH48H11) #2569 | |
| Tissue Cassette | |||
| Toluidine Blue | ACROS Organics | 348600050 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| TRIzol | Invitrogen | 15596026 | |
| Trypsin | Corning | 25-051-31 |
References
- Carroll, S. L. Molecular mechanisms promoting the pathogenesis of Schwann cell neoplasms. Acta Neuropathologica. 123 (3), 321-348 (2012).
- Longo, J. F., Weber, S. M., Turner-Ivey, B. P., Carroll, S. L.
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved