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In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Desenvolvemos uma metodologia para avaliar se neoplasias do sistema nervoso em camundongos geneticamente modificados recapitulam com precisão a patologia de suas contrapartes humanas. Aqui, aplicamos essas técnicas histológicas, critérios patológicos definidos e metodologias de cultura para neurofibromas e tumores malignos da bainha de nervos periféricos que surgem no modelo de camundongos P 0-GGFβ3.

Abstract

Pacientes com a síndrome de suscetibilidade tumoral autossômica dominante neurofibromatose tipo 1 (NF1) comumente desenvolvem neurofibromas plexiformes (NPs) que posteriormente se transformam em tumores malignos altamente agressivos da bainha do nervo periférico (MPNSTs). A compreensão do processo pelo qual um PN se transforma em um MPNST seria facilitada pela disponibilidade de modelos de camundongos geneticamente modificados (GEM) que replicam com precisão a progressão PN-MPNST observada em humanos com NF1. Infelizmente, os modelos de GEM com ablação de Nf1 não recapitulam totalmente esse processo. Isso nos levou a desenvolver camundongos P 0-GGFβ3, um modelo de GEM no qual a superexpressão da neuregulina-1 mitógena de células de Schwann (NRG1) em células de Schwann resulta no desenvolvimento de PNs que progridem para se tornarem MPNSTs com alta frequência. No entanto, para determinar se a tumorigênese e a progressão neoplásica em camundongos P 0-GGFβ3 modelam com precisão os processos observados em pacientes com NF1, tivemos que primeiro provar que a patologia dos tumores da bainha do nervo periférico P0-GGFβ3 recapitula a patologia de seus homólogos humanos.

Aqui, descrevemos as metodologias especializadas usadas para diagnosticar e graduar com precisão neoplasias do sistema nervoso periférico em modelos de GEM, usando P 0-GGFβ3 e P0-GGFβ3; Ratos Trp53+/- como exemplo. Descrevemos os métodos histológicos, imuno-histoquímicos e histoquímicos utilizados para diagnosticar NPs e MPNSTs, como distinguir essas neoplasias de outros tipos de tumores que mimetizam sua patologia e como graduar essas neoplasias. Discutimos o estabelecimento de culturas de passagem precoce a partir de MPNSTs GEM, como caracterizar essas culturas por imunocitoquímica e como verificar sua tumorigenicidade através do estabelecimento de aloenxertos. Coletivamente, essas técnicas caracterizam a patologia de NPs e MPNSTs que surgem em modelos de GEM e comparam criticamente a patologia desses tumores murinos com seus homólogos humanos.

Introduction

Nas últimas três décadas, vários laboratórios tentaram criar modelos de camundongos de cânceres humanos introduzindo mutações associadas ao câncer humano no genoma de camundongos ou superexpressando um produto genético que é superexpresso em cânceres humanos. Os modelos de camundongos geneticamente modificados (GEM) resultantes podem ser usados para uma variedade de propósitos, como estabelecer que a modificação genômica recém-introduzida inicia a tumorigênese, identificar outras alterações genéticas ou epigenéticas que ocorrem subsequentemente que contribuem para a progressão do tumor e definir as principais vias de sinalização que impulsionam a iniciação e a progres....

Protocol

Os procedimentos aqui descritos foram aprovados pela IACUC da Medical University of South Carolina e foram realizados por pessoal devidamente treinado, de acordo com o NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals e as diretrizes institucionais de cuidados com animais do MUSC.

1. Determinação da penetrância e sobrevivência tumoral em camundongos P 0-GGFβ3 e identificação de tumores nestes animais para posterior caracterização

  1. Gerar a coorte.......

Representative Results

A Figura 2 ilustra exemplos de neoplasias grosseiramente evidentes surgindo em camundongos P 0-GGFβ3. Tumores facilmente identificáveis a olho nu podem ser vistos como massas distendendo regiões do corpo, como mostra a Figura 2A (seta). Ao determinar se a neoplasia é potencialmente um tumor da bainha do nervo periférico, é essencial estabelecer que o tumor está associado a um nervo periférico. Neste caso, a ressonância magnética (

Discussion

Os métodos histológicos e bioquímicos aqui apresentados fornecem uma estrutura para diagnosticar e caracterizar modelos de GEMs na patogênese do neurofibroma e do MPNST. Ao longo dos anos, essas metodologias têm sido bastante úteis para avaliar a patologia dos tumores da bainha dos nervos periféricos que surgem em modelos deGEM21,25,26. No entanto, embora os protocolos aqui descritos sejam úteis para determinar com que p.......

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado por bolsas do National Institute of Neurological Diseases and Stroke (R01 NS048353 e R01 NS109655 para S.L.C.; R01 NS109655-03S1 para D.P.J.), o Instituto Nacional do Câncer (R01 CA122804 para S.L.C.) e o Departamento de Defesa (X81XWH-09-1-0086 e W81XWH-12-1-0164 para S.L.C.).

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Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
100 mm Tissue Culture PlatesCorning Falcon353003
3, 3'- Diaminobensidine (DAB)Vector LaboratoriesSK-400
6- well platesCorning Costar3516
Acetic AcidFisher ScientificA38-212
Alexa Fluor 488 Secondary (Goat Anti-Mouse)InvitrogenA11029
Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Mouse)InvitrogenA21043 or A11004
Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Rabbit)InvitrogenA11036
Ammonium Chloride (NH4Cl)Fisher ScientificA661-500
BCA Protein Assay KitThermo Scientific23225
Bovine Serum AlbuminFisher ScientificBP1600-100
CaldesmonABCAM E89, ab32330
CD117Cell Marque117R-18-ASR
CD163LeicaNCL-L-CD163
CD31ABCAM ab29364
CD34ABCAM ab81289
CD86ABCAM ab53004
Cell ScraperSarstedt83.183
Cell StripperCorning25-056-CI
Circle CoverslipFisher Scientific12-545-100
Citrisolve Hybrid (d-limonene-based solvent)Decon Laboratories5989-27-5
Critic AcidFisher ScientificA104-500
CytokeratinABCAM C-11, ab7753
DesminAgilent Dako clone D33 (M0760)
Diaminobensizdine (DAB) SolutionVector LaboratoriesSK-4100
DMEMCorning15-013-CV
Eosin YThermo Scientific7111
Ethanol (200 Proof)Decon Laboratories2716
Fetal Calf SerumOmega ScientificFB-01
ForksolinSigma-AldrichF6886
GlycerolSigma-AldrichG6279
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)Corning21-022-CV
Harris HematoxylinFisherbrand245-677
HemacytometerBrightline-Hauser Scientific1490
Hydrochloric AcidFisher ScientificA144-212
Hydrogen PeroxideFisher Scientific327-500
Iba1Wako Chemicals019-19741
ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit ,Mouse on MouseVector LaboratoriesMP-2400
ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit, Horse Anti-RabbitVector LaboratoriesMP-7401
IncubatorThermo ScientificHeracell 240i CO2 incubator
IsofluranePiramalNDC 66794-017-25
IsopropanolFisher ScientificA415
Ki-67Cell Signaling 12202
LamininThermo Fisher Scientific23017015
Liquid Nitrogen
MART1ABCAM M2-9E3, ab187369
Microtome
NestinMillipore Human: MAD5236 (10C2), Human:MAB353 (Rat-401)
Neuregulin 1 betaIn houseMade by S.L.C. (also available as 396-HB-050/CF from R&D Systems)
NeurofibrominSanta Cruz Biotechnology sc-67
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ miceJackson Laboratory5557
Nonfat Dry MilkWalmartGreat Value Brand
P0-GGFβ3 miceIn house
Paraffin WaxLeicaParaplast 39601006
Parafilm MSigma-AldrichPM-999
Paraformaldehyde (4%)Thermo ScientificJ19943-K2
Permount (Xylene Mounting Medium)Fisher ScientificSP15-100
pH MeterMettler ToldedoSeven Excellence, 8603
Phosphate Buffered Saline (Dulbecco's)Corning20-031-CV
PMELABCAM EP4863(2), ab137078
Poly-L-Lysine HydrobromideSigma-AldrichP5899-5MG
Portable Isoflurance MachineVetEquip Inhalation Anesthesia Systems
PVA-DABCO (Aqueous Mounting Medium)Millipore Sigma10981100ML
Rice CookerBeech Hamilton
S100BAgilent Dako Z0311  (now GA504)
SMAVentana Medical Systems clone 1A4
Sodium ChlorideFisher ScientificS640
Sodium Citrate (Dihydrate)Fisher ScientificBP327-1
Sox10ABCAM ab212843
Steel histology mold
Superfrost Plus Microscope SlidesFisher Scientific12-550-15
TCF4/TCFL2 Cell Signaling (CH48H11) #2569
Tissue Cassette
Toluidine BlueACROS Organics348600050
Triton X-100Fisher ScientificBP151-500
TRIzolInvitrogen15596026
TrypsinCorning25-051-31

References

  1. Carroll, S. L. Molecular mechanisms promoting the pathogenesis of Schwann cell neoplasms. Acta Neuropathologica. 123 (3), 321-348 (2012).
  2. Longo, J. F., Weber, S. M., Turner-Ivey, B. P., Carroll, S. L.

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