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Desenvolvemos uma metodologia para avaliar se neoplasias do sistema nervoso em camundongos geneticamente modificados recapitulam com precisão a patologia de suas contrapartes humanas. Aqui, aplicamos essas técnicas histológicas, critérios patológicos definidos e metodologias de cultura para neurofibromas e tumores malignos da bainha de nervos periféricos que surgem no modelo de camundongos P 0-GGFβ3.
Pacientes com a síndrome de suscetibilidade tumoral autossômica dominante neurofibromatose tipo 1 (NF1) comumente desenvolvem neurofibromas plexiformes (NPs) que posteriormente se transformam em tumores malignos altamente agressivos da bainha do nervo periférico (MPNSTs). A compreensão do processo pelo qual um PN se transforma em um MPNST seria facilitada pela disponibilidade de modelos de camundongos geneticamente modificados (GEM) que replicam com precisão a progressão PN-MPNST observada em humanos com NF1. Infelizmente, os modelos de GEM com ablação de Nf1 não recapitulam totalmente esse processo. Isso nos levou a desenvolver camundongos P 0-GGFβ3, um modelo de GEM no qual a superexpressão da neuregulina-1 mitógena de células de Schwann (NRG1) em células de Schwann resulta no desenvolvimento de PNs que progridem para se tornarem MPNSTs com alta frequência. No entanto, para determinar se a tumorigênese e a progressão neoplásica em camundongos P 0-GGFβ3 modelam com precisão os processos observados em pacientes com NF1, tivemos que primeiro provar que a patologia dos tumores da bainha do nervo periférico P0-GGFβ3 recapitula a patologia de seus homólogos humanos.
Aqui, descrevemos as metodologias especializadas usadas para diagnosticar e graduar com precisão neoplasias do sistema nervoso periférico em modelos de GEM, usando P 0-GGFβ3 e P0-GGFβ3; Ratos Trp53+/- como exemplo. Descrevemos os métodos histológicos, imuno-histoquímicos e histoquímicos utilizados para diagnosticar NPs e MPNSTs, como distinguir essas neoplasias de outros tipos de tumores que mimetizam sua patologia e como graduar essas neoplasias. Discutimos o estabelecimento de culturas de passagem precoce a partir de MPNSTs GEM, como caracterizar essas culturas por imunocitoquímica e como verificar sua tumorigenicidade através do estabelecimento de aloenxertos. Coletivamente, essas técnicas caracterizam a patologia de NPs e MPNSTs que surgem em modelos de GEM e comparam criticamente a patologia desses tumores murinos com seus homólogos humanos.
Nas últimas três décadas, vários laboratórios tentaram criar modelos de camundongos de cânceres humanos introduzindo mutações associadas ao câncer humano no genoma de camundongos ou superexpressando um produto genético que é superexpresso em cânceres humanos. Os modelos de camundongos geneticamente modificados (GEM) resultantes podem ser usados para uma variedade de propósitos, como estabelecer que a modificação genômica recém-introduzida inicia a tumorigênese, identificar outras alterações genéticas ou epigenéticas que ocorrem subsequentemente que contribuem para a progressão do tumor e definir as principais vias de sinalização que impulsionam a iniciação e a progres....
Os procedimentos aqui descritos foram aprovados pela IACUC da Medical University of South Carolina e foram realizados por pessoal devidamente treinado, de acordo com o NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals e as diretrizes institucionais de cuidados com animais do MUSC.
1. Determinação da penetrância e sobrevivência tumoral em camundongos P 0-GGFβ3 e identificação de tumores nestes animais para posterior caracterização
A Figura 2 ilustra exemplos de neoplasias grosseiramente evidentes surgindo em camundongos P 0-GGFβ3. Tumores facilmente identificáveis a olho nu podem ser vistos como massas distendendo regiões do corpo, como mostra a Figura 2A (seta). Ao determinar se a neoplasia é potencialmente um tumor da bainha do nervo periférico, é essencial estabelecer que o tumor está associado a um nervo periférico. Neste caso, a ressonância magnética (
Os métodos histológicos e bioquímicos aqui apresentados fornecem uma estrutura para diagnosticar e caracterizar modelos de GEMs na patogênese do neurofibroma e do MPNST. Ao longo dos anos, essas metodologias têm sido bastante úteis para avaliar a patologia dos tumores da bainha dos nervos periféricos que surgem em modelos deGEM21,25,26. No entanto, embora os protocolos aqui descritos sejam úteis para determinar com que p.......
Este trabalho foi apoiado por bolsas do National Institute of Neurological Diseases and Stroke (R01 NS048353 e R01 NS109655 para S.L.C.; R01 NS109655-03S1 para D.P.J.), o Instituto Nacional do Câncer (R01 CA122804 para S.L.C.) e o Departamento de Defesa (X81XWH-09-1-0086 e W81XWH-12-1-0164 para S.L.C.).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
100 mm Tissue Culture Plates | Corning Falcon | 353003 | |
3, 3'- Diaminobensidine (DAB) | Vector Laboratories | SK-400 | |
6- well plates | Corning Costar | 3516 | |
Acetic Acid | Fisher Scientific | A38-212 | |
Alexa Fluor 488 Secondary (Goat Anti-Mouse) | Invitrogen | A11029 | |
Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Mouse) | Invitrogen | A21043 or A11004 | |
Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Rabbit) | Invitrogen | A11036 | |
Ammonium Chloride (NH4Cl) | Fisher Scientific | A661-500 | |
BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
Caldesmon | ABCAM | E89, ab32330 | |
CD117 | Cell Marque | 117R-18-ASR | |
CD163 | Leica | NCL-L-CD163 | |
CD31 | ABCAM | ab29364 | |
CD34 | ABCAM | ab81289 | |
CD86 | ABCAM | ab53004 | |
Cell Scraper | Sarstedt | 83.183 | |
Cell Stripper | Corning | 25-056-CI | |
Circle Coverslip | Fisher Scientific | 12-545-100 | |
Citrisolve Hybrid (d-limonene-based solvent) | Decon Laboratories | 5989-27-5 | |
Critic Acid | Fisher Scientific | A104-500 | |
Cytokeratin | ABCAM | C-11, ab7753 | |
Desmin | Agilent Dako | clone D33 (M0760) | |
Diaminobensizdine (DAB) Solution | Vector Laboratories | SK-4100 | |
DMEM | Corning | 15-013-CV | |
Eosin Y | Thermo Scientific | 7111 | |
Ethanol (200 Proof) | Decon Laboratories | 2716 | |
Fetal Calf Serum | Omega Scientific | FB-01 | |
Forksolin | Sigma-Aldrich | F6886 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G6279 | |
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | 21-022-CV | |
Harris Hematoxylin | Fisherbrand | 245-677 | |
Hemacytometer | Brightline-Hauser Scientific | 1490 | |
Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-212 | |
Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | 327-500 | |
Iba1 | Wako Chemicals | 019-19741 | |
ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit ,Mouse on Mouse | Vector Laboratories | MP-2400 | |
ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit, Horse Anti-Rabbit | Vector Laboratories | MP-7401 | |
Incubator | Thermo Scientific | Heracell 240i CO2 incubator | |
Isoflurane | Piramal | NDC 66794-017-25 | |
Isopropanol | Fisher Scientific | A415 | |
Ki-67 | Cell Signaling | 12202 | |
Laminin | Thermo Fisher Scientific | 23017015 | |
Liquid Nitrogen | |||
MART1 | ABCAM | M2-9E3, ab187369 | |
Microtome | |||
Nestin | Millipore | Human: MAD5236 (10C2), Human:MAB353 (Rat-401) | |
Neuregulin 1 beta | In house | Made by S.L.C. (also available as 396-HB-050/CF from R&D Systems) | |
Neurofibromin | Santa Cruz Biotechnology | sc-67 | |
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ mice | Jackson Laboratory | 5557 | |
Nonfat Dry Milk | Walmart | Great Value Brand | |
P0-GGFβ3 mice | In house | ||
Paraffin Wax | Leica | Paraplast 39601006 | |
Parafilm M | Sigma-Aldrich | PM-999 | |
Paraformaldehyde (4%) | Thermo Scientific | J19943-K2 | |
Permount (Xylene Mounting Medium) | Fisher Scientific | SP15-100 | |
pH Meter | Mettler Toldedo | Seven Excellence, 8603 | |
Phosphate Buffered Saline (Dulbecco's) | Corning | 20-031-CV | |
PMEL | ABCAM | EP4863(2), ab137078 | |
Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P5899-5MG | |
Portable Isoflurance Machine | VetEquip Inhalation Anesthesia Systems | ||
PVA-DABCO (Aqueous Mounting Medium) | Millipore Sigma | 10981100ML | |
Rice Cooker | Beech Hamilton | ||
S100B | Agilent Dako | Z0311 (now GA504) | |
SMA | Ventana Medical Systems | clone 1A4 | |
Sodium Chloride | Fisher Scientific | S640 | |
Sodium Citrate (Dihydrate) | Fisher Scientific | BP327-1 | |
Sox10 | ABCAM | ab212843 | |
Steel histology mold | |||
Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
TCF4/TCFL2 | Cell Signaling | (CH48H11) #2569 | |
Tissue Cassette | |||
Toluidine Blue | ACROS Organics | 348600050 | |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
TRIzol | Invitrogen | 15596026 | |
Trypsin | Corning | 25-051-31 |
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