Fibertypsidentifiering av mänsklig skelettmuskulatur

Tekniken som beskrivs här kan användas för att identifiera specifika isoformer av tunga myosinkedjor (MHC) i segment av enskilda muskelfibrer med hjälp av punktblotting, hädanefter kallad Myosin heavy chain detection genom Dot B-lottningför ID-entifieringav muskelfibertyp (MyDoBID). Detta protokoll beskriver processen att frystorka mänsklig skelettmuskulatur och isolera segment av enstaka muskelfibrer. Med hjälp av MyDoBID klassificeras typ I- och II-fibrer med MHCI- respektive IIa-specifika antikroppar. Klassificerade fibrer kombineras sedan till fibertypspecifika prover för varje biopsi.

Det totala proteinet i varje prov bestäms av natriumdodecylsulfatpolyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) och UV-aktiverad gelteknik. Fibertypen av prover valideras med hjälp av western blotting. Vikten av att utföra normalisering av proteinbelastning för att förbättra detektionen av målproteiner över flera västerländska fläckar beskrivs också. Fördelarna med att konsolidera klassificerade fibrer till fibertypsspecifika prover jämfört med enfiberiga western blots, inkluderar provmångsidighet, ökad provgenomströmning, kortare tidsinvestering och kostnadsbesparande åtgärder, samtidigt som värdefull fibertypspecifik information som ofta förbises med hjälp av homogeniserade muskelprover. Syftet med protokollet är att uppnå noggrann och effektiv identifiering av typ I- och typ II-fibrer isolerade från frystorkade mänskliga skelettmuskelprover.

Dessa enskilda fibrer kombineras sedan för att skapa typ I- och typ II-fibertypspecifika prover. Dessutom utvidgas protokollet till att omfatta identifiering av typ IIx-fibrer, med aktin som markör för fibrer som var negativa för MHCI och MHCIIa, vilka bekräftas som IIx-fibrer genom western blotting. Varje fibertypsspecifikt prov används sedan för att kvantifiera uttrycket av olika målproteiner med hjälp av western blotting-tekniker.