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In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Questo manoscritto descrive in dettaglio un protocollo di inoculazione ottimizzato che utilizza guaine fogliari di mais staccate per studi citologici, fisiologici e molecolari riproducibili delle interazioni del mais con i patogeni fungini delle piante. Le guaine fogliari facilitano l'osservazione in tempo reale delle interazioni cellulari tra la pianta vivente e il fungo nei tessuti non fissati.

Abstract

Abbiamo ottimizzato un protocollo per inoculare guaine fogliari di mais con funghi patogeni fogliari emibiotrofi e necrotrofi. Il metodo è modificato da quello originariamente applicato alle guaine delle foglie di riso e consente l'osservazione microscopica diretta della crescita e dello sviluppo dei funghi nelle cellule vegetali viventi. Le guaine fogliari raccolte da piantine di mais con due colletti fogliari completamente emersi vengono inoculate con gocce da 20 μL di 5 x 105 spore/mL di sospensioni di spore fungine e incubate in camere di umidità a 23 °C sotto luce fluorescente continua. Dopo 24-72 ore, il tessuto in eccesso viene rimosso con una lama di rasoio per lasciare un singolo strato di cellule epidermiche, un campione otticamente trasparente che può essere visualizzato direttamente senza la necessità di fissazione chimica o pulizia. Le cellule vegetali e fungine rimangono in vita per tutta la durata dell'esperimento e le interazioni possono essere visualizzate in tempo reale. Le guaine possono essere colorate o sottoposte a plasmolisi per studiare la citologia dello sviluppo e la vitalità delle cellule ospiti e patogene durante l'infezione e la colonizzazione. I ceppi fungini trasformati per esprimere proteine fluorescenti possono essere inoculati o co-inoculati sulle guaine per una maggiore risoluzione e per facilitare la valutazione di interazioni competitive o sinergiche. I ceppi fungini che esprimono proteine di fusione fluorescenti possono essere utilizzati per tracciare e quantificare la produzione e il targeting di queste singole proteine nelle piante. I tessuti della guaina inoculati possono essere estratti per caratterizzare acidi nucleici, proteine o metaboliti. L'uso di questi saggi di guaina ha notevolmente fatto progredire gli studi dettagliati dei meccanismi di patogenicità fungina nel mais e anche degli effettori proteici fungini e dei metaboliti secondari che contribuiscono alla patogenicità.

Introduction

Le analisi spaziali e temporali a livello cellulare sono fondamentali per comprendere la fisiologia e la citologia delle interazioni fungo-pianta. I tessuti fogliari che sono stati fissati chimicamente 1,2,3 o eliminati e colorati4, così come le membrane artificiali 5, sono stati utilizzati in passato per studiare la citologia dello sviluppo dei patogeni fogliari e le interazioni pianta-fungo. Tuttavia, lo studio degli eventi di infezione nei tessuti viventi dell'ospite in tempo reale senza fissazione o chiarificazione è impegna....

Protocol

NOTA: il flusso di lavoro per il metodo è illustrato nella Figura 1.

figure-protocol-195
Figura 1: Fasi del protocollo di inoculo ottimizzato utilizzando guaine fogliari di mais staccate. La preparazione della sospensione di spore, l'inoculazione della guaina fogliare e la preparazione del campione per la micro.......

Representative Results

Gli esempi seguenti descrivono i risultati rappresentativi in seguito all'uso del metodo di inoculazione della guaina fogliare di mais. Questi esempi dimostrano la facilità, la velocità e la precisione con cui l'osservazione e il confronto delle interazioni mais-funghi possono essere realizzati in tempo reale con questo saggio ottimizzato. L'imaging di cellule vive consente anche l'estrazione di informazioni quantitative, fornendo uno strumento utile per studi molecolari, citologici e fisiologici comparativi. Ulteriori.......

Discussion

Il metodo di inoculazione della guaina fogliare ottimizzato qui descritto è modificato da un protocollo originale che è stato sviluppato ed è stato applicato alle guaine fogliari di riso 6,8,36. Consente osservazioni dirette e dettagliate della crescita e dello sviluppo fungino nelle cellule vegetali viventi con microscopia a campo largo o confocale. Il protocollo è adatto per la caratterizzazione, il confronto e la quantifi.......

Acknowledgements

Gli autori ringraziano l'USDA-NIFA per il loro sostegno finanziario (numeri di sovvenzione 2018-67013-28489 e 2020-70410-32901). Tutte le opinioni, i risultati, le conclusioni o le raccomandazioni espresse in questo manoscritto sono esclusivamente quelle degli autori e non riflettono necessariamente le opinioni del Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti. Ringraziamo la studentessa brasiliana di Science Without Borders, Mayara de Silva, per le immagini che appaiono nella Figura 6A e nella Figura 7D. Ringraziamo anche il Dipartimento di Patologia Vegetale dell'Università del Kentucky per aver fornito l'accesso ai microscopi con....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Axiocam monochrome microscope cameraZEISS426560-9010-000Compatible with the Axioplan 2 microscope; provides low read noise and high speed for live cell imaging
Axioplan 2 epifluorescence microscopeZEISSN/AAllows live viewing and image/video capture of biological samples 
Benchtop centrifuge 24 X 1.5/2 mLThermo Fisher Scientific75002431Sorvall Legend Micro 17; max speed: 13,300 rpm (17,000 x g)
Falcon bacteriological Petri dish with lidFisher Scientific08-757-105Polystyrene material; hydrophobic surface
Filter paper Fisher Scientific09-920-115Whatman grade 1 for Petri plate moist chambers
FV 3000 laser scanning confocal microscopeOlympusN/AFor visualization of fungal transformants' 
Germination paperAnchor Paper Co.SD7615L76# heavy weight for plastic box moist chambers
Glass Petri dishesVWR International75845-542Type 1 class A, 33 expansion borosilicate glass;
complete set (cover + bottom), for Petri plate moist chambers
Glass wool Ohio Valley Specialty Chemical 3350For glass-wool filter units
Hemocytometer/Neubauer counting chamber and cover glassVWR International15170-1720.1 mm chamber depth; comes with two 0.4 mm cover glasses
Microscope coverslipsFisher Scientific12-553-457 Borosilicate glass; 100/Pk.; 22 mm length, 22 mm width
Maize cultivar Golden Jubilee seedsWest Coast Seeds Ltd., Delta, BC, CanadaCN361Matures in 95-105 days; seed type: F1
Microcentrifuge tubes USA Scientific  1415-25001.5 mL capacity
Microscope slides Fisher Scientific12-550-123 Superfrost white tab slide; 76 mm length, 25 mm width
Oatmeal Agar (OA)VWR International255210Difco Oatmeal Agar, BD; 500 g
Nail polishRevlon43671Clear nail polish for sealing microscope slides; color 771 Clear
Non-skirted 96-well PCR plateUSA Sientific1402-9500100 uL plate volume
Pestle for microcentrifuge tubesUSA Scientific 1415-5390Conical tip; polypropylene material
PlanApo 60X/1,00 WLSM water objective Olympus1-UB933Compatible with the Olympus FV 3000 confocal microscope
Potato Dextrose Agar (PDA)VWR International90000-758Difco Potato Dextrose Media, BD; 500 g
Pro-Mix BXPremium Horticulture Supply Co.N/APremium general-purpose growing medium formulated to provide
a balance of water retention and proper drainage
SC10 cone-tainers Greenhouse Megastore CN-SS-SC-10B1.5 inch diameter, 8.25 inch depth, and a volume of 164 mL
SC10 cone-tainers trayGreenhouse Megastore CN-SS-SCTR9824 inch length x 12 inch width x 6.75 inch height; holds up to 98 of SC10 cone-tainers
Single edge razor bladeThermo Fisher Scientific17-989-145AccuTec blade; steel material; 38 mm length blade
Storage containers/boxes with latch closureTarget002-02-0405Clear view storage boxes for rmoist chamber;
outside dimensions: 23 5/8 inch x 16 3/8 inch x 6 1/2 inch; 32 qt. capacity

References

  1. Cheng, Y., Yao, J., Zhang, H., Huang, L., Kang, Z. Cytological and molecular analysis of nonhost resistance in rice to wheat powdery mildew and leaf rust pathogens. Protoplasma. 252 (4), 1167-1179 (2015).
  2. Hickey, E. L., Coffey, M. D.

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