A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול פשוט המאפשר הערכה חוץ גופית של שפע המיקרו-רנ"א המסומן באופן פלואורסצנטי כדי לחקור את הדינמיקה של אריזות מיקרו-רנ"א ולייצא לשלפוחיות חוץ-תאיות (EV).
שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) הן מתווכות חשובות של תקשורת תאית המופרשות על-ידי מגוון תאים שונים. כלי רכב חשמליים אלה מעבירים מולקולות ביו-אקטיביות, כולל חלבונים, שומנים וחומצות גרעין (דנ"א, mRNAs, מיקרו-רנ"א ורנ"א לא מקודד אחר), מתא אחד למשנהו, מה שמוביל לתוצאות פנוטיפיות בתאים המקבלים. מכל מטעני הרכב החשמליים השונים, מיקרו-רנ"א (miRNAs) זכו לתשומת לב רבה בשל תפקידם בעיצוב המיקרו-סביבה ובחינוך התאים המקבלים בשל חוסר הוויסות הברור שלהם והשפע שלהם ברכב חשמלי. נתונים נוספים מצביעים על כך שהרבה miRNA נטענים באופן פעיל לתוך כלי רכב חשמליים. למרות ראיות ברורות אלה, המחקר על הדינמיקה של הייצוא ומנגנוני מיון miRNA מוגבל. כאן, אנו מספקים פרוטוקול באמצעות ניתוח ציטומטריית זרימה של EV-miRNA שניתן להשתמש בו כדי להבין את הדינמיקה של טעינת EV-miRNA ולזהות את המכונות המעורבות בייצוא miRNA. בפרוטוקול זה, miRNA שנקבע מראש כי הוא מועשר ברכבים חשמליים ומדולדל מתאי התורם מצומד לפלואורופור ומוזרם לתאי התורם. לאחר מכן, ה-miRNA המתויגים באופן פלואורסצנטי מאומתים לטעינה לרכבים חשמליים ולהתרוקנות מתאים באמצעות qRT-PCR. הן כבקרת טרנספקציה והן ככלי לנטרול אוכלוסיית התאים הנגועים, נכלל רנ"א תאי עם תווית פלואורסצנטית (תאים שמורים ומרוקנים מ-EV). תאים הנגועים הן ב-EV-miRNA והן ב-miRNA שנשמר בתאים מוערכים לאותות פלואורסצנטיים במהלך 72 שעות. עוצמת האות הפלואורסצנטי הספציפית ל-EV-miRNA פוחתת במהירות בהשוואה ל-miRNA השמור בתאים. באמצעות פרוטוקול פשוט זה, ניתן כעת להעריך את הדינמיקה של טעינת miRNA ולזהות גורמים שונים האחראים לטעינת miRNA לתוך כלי רכב חשמליים.
מיקרו-רנ"א (miRNAs) הוא אחת מתת-הקבוצות המאופיינות ביותר של רנ"א קטן שאינו מקודד, הידועות בתפקידן הקריטי בוויסות גנים לאחר שעתוק. הביטוי והביוגנזה של רוב ה-miRNAs עוקבים אחר סדרה מתואמת של אירועים שמתחילה בשעתוק של ה-miRNA הראשוני (pri-miRNAs) בגרעין. לאחר עיבוד גרעיני על ידי קומפלקס המיקרו-מעבדים לתוך precursor-miRNA (pre-miRNAs), pre-miRNAs מיוצאים לציטופלסמה, שם הם עוברים עיבוד נוסף על ידי אנדונוקלאז RNase III, dicer לתוך 21-23 נוקלאוטיד בוגר miRNA דופלקסים1. אחד הגדילים של ה-miRNA הבוגר המעובד נקשר ל-mRNA שליח המטרה (mRNAs), מה שמוביל לפירוק או לדיכוי תרגומי של המטרות2. בהתבסס על התפקיד הפליוטרופי של miRNAs בוויסות ס....
הערה: כתנאי מוקדם לשימוש בטכניקה זו, נדרש זיהוי ואימות של miRNA המיוצאים באופן סלקטיבי. מאחר שקווי תאים שונים משתנים בהתאם למטען ה-miRNA הממוין לרכבים החשמליים שלהם, מומלץ להעריך את קו התאים המעניין ואת כלי הרכב החשמליים הקשורים אליו לפני השימוש. בנוסף, טרנספקציה מבוססת ליפופקטמין היא אחד השלב?.......
כאן, אנו משתמשים בציטומטריית זרימה ככלי רב עוצמה לחקר שחרור miRNA מהתאים לרכבים חשמליים. באמצעות פרוטוקול זה, ניתוח ציטומטריית זרימה של תאים הנגועים ב-cell-miRNA וב-EV-miRNA גילה ירידה רציפה של אות פלואורסצנטי המתאים ל-EV-miRNA, בעוד שהאות המתאים ל-miRNA התא נשמר בתאים. כדי להבטיח שהצמידות של הפלואורופורים .......
הפרוטוקול החדש שהוקם מאפשר לכידת קינטיקה של שחרור miRNA לרכבים חשמליים לאחר טרנספקציה של EV-miRNAs. הגישה מאפשרת ניתוח סימולטני של מספר רב של EV-miRNA ו-cell-miRNAs, בכפוף ליכולות הציטומטר. יתר על כן, בעוד ניתוח ציטומטריית זרימה יכול לספק תובנות חשובות על ביולוגיה miRNA EV, זה לא בלי מגבלות. אם כי ניתן להתגבר ע.......
אנו מכירים בתמיכה ובייעוץ מד"ר ג'יל האצ'קרופט, מנהלת מתקן הליבה של Flow Cytometry באוניברסיטת Purdue. עבודה זו נתמכה על ידי R01CA226259 ו- R01CA205420 ל- A.L.K., פרס חדשנות של איגוד הריאות האמריקאי (ANALA2023) IA-1059916 ל- A.L.K., מענק מתקן משאבים משותפים של Purdue P30CA023168, ומלגת דגל פולברייט לדוקטורט שהוענקה על ידי מחלקת המדינה, ארה"ב ל- H.H.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
15 mL Falcon tubes | Corning | 352097 | |
6-well clear flat bottom surface treated tissue culture plates | Fisher Scientific | FB012927 | |
ApogeeMix 25 mL, (PS80/110/500 & Si180/240/300/590/880/1300 nm) | Apogee Flow Systems | 1527 | To set up gating and parameters for particle detection |
Attune Nxt Flow Cytometer | ThermoFisher Scientific | N/A | For fluorescence analysis in EVs |
BD Fortessa Cell Analyzer | BD Biosciences | N/A | For fluorescence analysis in cells |
Cell culture incubator | N/A | N/A | Maintaining temperature of 37 °C and 5% CO2 |
Cell Culture medium | N/A | N/A | specific for the cell-line of interest |
Cell line of interest | N/A | N/A | Any cell line tested and evaluated for EV and cellular abundance of miRNAs on interest. |
Cell-miRNA (miRIDIAN microRNA Mimic Red Transfection Control) | Horizon discovery | CP-004500-01-05 | miRNAs predetermined to be retained by the cell-line of interest and not selectively exported out into EVs |
EV-miRNA (Fluorophore conjugated miRNAs) | Integrated DNA Technologies (IDT) | miRNAs predetermined to be selectively sorted into EVs | |
Fluorescence microscope | N/A | N/A | |
Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium | Fisher Scientific | 31-985-070 | |
Hausser Scientific Hemocytometer | Fisher | 02-671-54 | |
Hyclone 1x PBS (for cell culture) | Fisher | SH30256FS | |
Lipofectamine RNAimax | Fisher Scientific | 13-778-150 | |
miRCURY LNA Reverse Transcriptase | Qiagen | 339340 | |
miRCURY LNA SYBR Green PCR | Qiagen | 339347 | |
mirVana RNA Isolation | Qiagen | AM1561 | |
Nuclease free water | Fisher Scientific | 4387936 | |
Paraformaldehyde, 4% in PBS | Fisher | AAJ61899AK | |
Reagent reservoir nonsterile | VWR | 89094-684 | |
Thermo ABI QuantiStudio DX Real-Time PCR | ThermoFisher Scientific | N/A | |
Trypsin 0.25% | Fisher | SH3004201 | |
Ultracentrifuge | N/A | N/A |
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved