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In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Aqui, descrevemos um protocolo simples que permite a avaliação in vitro da abundância de microRNAs marcados fluorescentemente para estudar a dinâmica do empacotamento de microRNA e exportação para vesículas extracelulares (EVs).

Abstract

As vesículas extracelulares (EVs) são importantes mediadores da comunicação celular que são secretadas por uma variedade de diferentes células. Esses EVs transportam moléculas bioativas, incluindo proteínas, lipídios e ácidos nucléicos (DNA, mRNAs, microRNAs e outros RNAs não codificantes), de uma célula para outra, levando a consequências fenotípicas nas células receptoras. De todas as várias cargas de EV, os microRNAs (miRNAs) têm recebido muita atenção por seu papel na formação do microambiente e na educação de células receptoras por causa de sua clara desregulação e abundância em EVs. Dados adicionais indicam que muitos miRNAs são ativamente carregados em EVs. Apesar dessas evidências claras, a pesquisa sobre a dinâmica de exportação e os mecanismos de classificação de miRNA é limitada. Aqui, nós fornecemos um protocolo usando a análise por citometria de fluxo de EV-miRNA que pode ser usado para entender a dinâmica de carregamento de EV-miRNA e identificar a maquinaria envolvida na exportação de miRNA. Nesse protocolo, os miRNAs pré-determinados para serem enriquecidos em EVs e depletados das células do doador são conjugados a um fluoróforo e transfectados para as células do doador. Os miRNAs fluorescentemente marcados são então verificados para carregamento em EVs e depleção de células usando qRT-PCR. Como um controle de transfecção e uma ferramenta para controlar a população transfectada de células, um RNA celular fluorescentemente marcado (retido e esgotado em EV) é incluído. Células transfectadas com o miRNA-EV e miRNA-retido celular são avaliadas para sinais fluorescentes ao longo de 72 h. A intensidade de sinal de fluorescência específica para os miRNAs EV diminui rapidamente em comparação com os miRNAs retidos na célula. Usando este protocolo simples, pode-se agora avaliar a dinâmica de carregamento de miRNA e identificar vários fatores responsáveis pela carga de miRNAs em EVs.

Introduction

MicroRNAs (miRNAs) são um dos subconjuntos mais bem caracterizados de pequenos RNAs não codificantes, que são conhecidos por seu papel crítico na regulação gênica pós-transcricional. A expressão e a biogênese da maioria dos miRNAs seguem uma série coordenada de eventos que começa com a transcrição dos miRNAs primários (pri-miRNAs) no núcleo. Após o processamento nuclear pelo complexo microprocessado em precursores-miRNAs (pré-miRNAs), os pré-miRNAs são exportados para o citoplasma, onde passam por processamento posterior pela RNase III endonuclease, dicer em 21-23 nucleotídeos maduros miRNA duplexes1. Uma das fitas do miRNA maduro processado li....

Protocol

NOTA: Como pré-requisito para o uso desta técnica, a identificação e validação de miRNAs exportados seletivamente é necessária. Uma vez que diferentes linhagens celulares variam com base na carga de miRNA classificada em seus EVs, recomenda-se que a linhagem celular de interesse e EVs associados sejam avaliados para miRNAs antes do uso. Além disso, a transfecção à base de lipofectamina é uma das etapas críticas do protocolo; Recomenda-se pré-determinar a eficiência da transfecção antes da instalação d.......

Representative Results

Aqui, utilizamos a citometria de fluxo como uma ferramenta poderosa para investigar a liberação de miRNA das células em EVs. Usando este protocolo, a análise por citometria de fluxo das células transfectadas com miRNA-celular e miRNA-EV revelou uma diminuição sequencial do sinal de fluorescência correspondente ao miRNA-EV, enquanto o sinal correspondente ao miRNA-celular foi retido nas células. Para garantir que a conjugação de fluoróforos não interfira na liberação de miRNA em EVs, o miR-451a foi conjugad.......

Discussion

O protocolo recém-estabelecido permite capturar a cinética de liberação de miRNA em EVs pós-transfecção de EV-miRNAs. A abordagem permite a análise simultânea de múltiplos miRNAs EV e miRNAs celulares, sujeitos às capacidades do citômetro. Além disso, embora a análise por citometria de fluxo possa fornecer informações valiosas sobre a biologia do miRNA EV, ela não está isenta de limitações. No entanto, algumas das limitações podem ser superadas quando utilizadas em conjunto com outras técnicas para.......

Acknowledgements

Agradecemos o apoio e o conselho da Dra. Jill Hutchcroft, Diretora do Centro de Citometria de Fluxo da Universidade de Purdue. Este trabalho foi apoiado por R01CA226259 e R01CA205420 para A.L.K., um American Lung Association Innovation Award (ANALA2023) IA-1059916 para A.L.K., um P30CA023168 de concessão de recursos compartilhados da Purdue e uma bolsa de doutorado Fulbright emblemática concedida pelo Departamento do Estado, EUA a H.H.

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Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL microcentrifuge tubesFisher05-408-129
15 mL Falcon tubesCorning352097
6-well clear flat bottom surface treated tissue culture platesFisher ScientificFB012927
ApogeeMix 25 mL, (PS80/110/500 & Si180/240/300/590/880/1300 nm) Apogee Flow Systems1527To set up gating and parameters for particle detection 
Attune Nxt Flow CytometerThermoFisher ScientificN/AFor fluorescence analysis in EVs
BD Fortessa Cell AnalyzerBD BiosciencesN/AFor fluorescence analysis in cells 
Cell culture incubatorN/AN/AMaintaining temperature of 37 °C and 5% CO2
Cell Culture mediumN/AN/Aspecific for the cell-line of interest
Cell line of interest N/AN/AAny cell line tested and evaluated for EV and cellular abundance of miRNAs on interest.
Cell-miRNA (miRIDIAN microRNA Mimic Red Transfection Control)Horizon discoveryCP-004500-01-05miRNAs predetermined to be retained by the cell-line of interest and not selectively exported out into EVs
EV-miRNA (Fluorophore conjugated miRNAs)Integrated DNA Technologies (IDT)miRNAs predetermined to be selectively sorted into EVs 
Fluorescence microscopeN/AN/A
Gibco Opti-MEM Reduced Serum MediumFisher Scientific31-985-070
Hausser Scientific HemocytometerFisher02-671-54
Hyclone 1x PBS (for cell culture)FisherSH30256FS
Lipofectamine RNAimaxFisher Scientific13-778-150
miRCURY LNA Reverse TranscriptaseQiagen339340
miRCURY LNA SYBR Green PCRQiagen 339347
mirVana RNA IsolationQiagenAM1561
Nuclease free waterFisher Scientific4387936
Paraformaldehyde, 4% in PBSFisherAAJ61899AK
Reagent reservoir nonsterileVWR89094-684
Thermo ABI QuantiStudio DX Real-Time PCRThermoFisher ScientificN/A
Trypsin 0.25%Fisher SH3004201
UltracentrifugeN/AN/A

References

  1. Kasinski, A. L., Slack, F. J. MicroRNAs en route to the clinic: Progress in validating and targeting microRNAs for cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 11 (12), 849-864 (2011).
  2. Treiber, T., Treiber, N., Meister, G.

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