Rastreando a liberação de miRNA em vesículas extracelulares usando citometria de fluxo

Summary

Aqui, descrevemos um protocolo simples que permite a avaliação in vitro da abundância de microRNAs marcados fluorescentemente para estudar a dinâmica do empacotamento de microRNA e exportação para vesículas extracelulares (EVs).

Abstract

As vesículas extracelulares (EVs) são importantes mediadores da comunicação celular que são secretadas por uma variedade de diferentes células. Esses EVs transportam moléculas bioativas, incluindo proteínas, lipídios e ácidos nucléicos (DNA, mRNAs, microRNAs e outros RNAs não codificantes), de uma célula para outra, levando a consequências fenotípicas nas células receptoras. De todas as várias cargas de EV, os microRNAs (miRNAs) têm recebido muita atenção por seu papel na formação do microambiente e na educação de células receptoras por causa de sua clara desregulação e abundância em EVs. Dados adicionais indicam que muitos miRNAs são ativamente carregados em EVs. Apesar dessas evidências claras, a pesquisa sobre a dinâmica de exportação e os mecanismos de classificação de miRNA é limitada. Aqui, nós fornecemos um protocolo usando a análise por citometria de fluxo de EV-miRNA que pode ser usado para entender a dinâmica de carregamento de EV-miRNA e identificar a maquinaria envolvida na exportação de miRNA. Nesse protocolo, os miRNAs pré-determinados para serem enriquecidos em EVs e depletados das células do doador são conjugados a um fluoróforo e transfectados para as células do doador. Os miRNAs fluorescentemente marcados são então verificados para carregamento em EVs e depleção de células usando qRT-PCR. Como um controle de transfecção e uma ferramenta para controlar a população transfectada de células, um RNA celular fluorescentemente marcado (retido e esgotado em EV) é incluído. Células transfectadas com o miRNA-EV e miRNA-retido celular são avaliadas para sinais fluorescentes ao longo de 72 h. A intensidade de sinal de fluorescência específica para os miRNAs EV diminui rapidamente em comparação com os miRNAs retidos na célula. Usando este protocolo simples, pode-se agora avaliar a dinâmica de carregamento de miRNA e identificar vários fatores responsáveis pela carga de miRNAs em EVs.

Introduction

MicroRNAs (miRNAs) são um dos subconjuntos mais bem caracterizados de pequenos RNAs não codificantes, que são conhecidos por seu papel crítico na regulação gênica pós-transcricional. A expressão e a biogênese da maioria dos miRNAs seguem uma série coordenada de eventos que começa com a transcrição dos miRNAs primários (pri-miRNAs) no núcleo. Após o processamento nuclear pelo complexo microprocessado em precursores-miRNAs (pré-miRNAs), os pré-miRNAs são exportados para o citoplasma, onde passam por processamento posterior pela RNase III endonuclease, dicer em 21-23 nucleotídeos maduros miRNA duplexes¹. Uma das fitas do miRNA maduro processado li....

Protocol

NOTA: Como pré-requisito para o uso desta técnica, a identificação e validação de miRNAs exportados seletivamente é necessária. Uma vez que diferentes linhagens celulares variam com base na carga de miRNA classificada em seus EVs, recomenda-se que a linhagem celular de interesse e EVs associados sejam avaliados para miRNAs antes do uso. Além disso, a transfecção à base de lipofectamina é uma das etapas críticas do protocolo; Recomenda-se pré-determinar a eficiência da transfecção antes da instalação d.......

Discussion

O protocolo recém-estabelecido permite capturar a cinética de liberação de miRNA em EVs pós-transfecção de EV-miRNAs. A abordagem permite a análise simultânea de múltiplos miRNAs EV e miRNAs celulares, sujeitos às capacidades do citômetro. Além disso, embora a análise por citometria de fluxo possa fornecer informações valiosas sobre a biologia do miRNA EV, ela não está isenta de limitações. No entanto, algumas das limitações podem ser superadas quando utilizadas em conjunto com outras técnicas para.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes	Fisher	05-408-129
15 mL Falcon tubes	Corning	352097
6-well clear flat bottom surface treated tissue culture plates	Fisher Scientific	FB012927
ApogeeMix 25 mL, (PS80/110/500 & Si180/240/300/590/880/1300 nm)	Apogee Flow Systems	1527	To set up gating and parameters for particle detection
Attune Nxt Flow Cytometer	ThermoFisher Scientific	N/A	For fluorescence analysis in EVs
BD Fortessa Cell Analyzer	BD Biosciences	N/A	For fluorescence analysis in cells
Cell culture incubator	N/A	N/A	Maintaining temperature of 37 °C and 5% CO2
Cell Culture medium	N/A	N/A	specific for the cell-line of interest
Cell line of interest	N/A	N/A	Any cell line tested and evaluated for EV and cellular abundance of miRNAs on interest.
Cell-miRNA (miRIDIAN microRNA Mimic Red Transfection Control)	Horizon discovery	CP-004500-01-05	miRNAs predetermined to be retained by the cell-line of interest and not selectively exported out into EVs
EV-miRNA (Fluorophore conjugated miRNAs)	Integrated DNA Technologies (IDT)		miRNAs predetermined to be selectively sorted into EVs
Fluorescence microscope	N/A	N/A
Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium	Fisher Scientific	31-985-070
Hausser Scientific Hemocytometer	Fisher	02-671-54
Hyclone 1x PBS (for cell culture)	Fisher	SH30256FS
Lipofectamine RNAimax	Fisher Scientific	13-778-150
miRCURY LNA Reverse Transcriptase	Qiagen	339340
miRCURY LNA SYBR Green PCR	Qiagen	339347
mirVana RNA Isolation	Qiagen	AM1561
Nuclease free water	Fisher Scientific	4387936
Paraformaldehyde, 4% in PBS	Fisher	AAJ61899AK
Reagent reservoir nonsterile	VWR	89094-684
Thermo ABI QuantiStudio DX Real-Time PCR	ThermoFisher Scientific	N/A
Trypsin 0.25%	Fisher	SH3004201
Ultracentrifuge	N/A	N/A