Отслеживание высвобождения микроРНК во внеклеточные везикулы с помощью проточной цитометрии

Summary

Здесь мы описываем простой протокол, который позволяет in vitro оценить обилие флуоресцентно меченных микроРНК для изучения динамики упаковки микроРНК и экспорта во внеклеточные везикулы (ВВ).

Abstract

Внеклеточные везикулы (ВВ) являются важными медиаторами клеточной коммуникации, которые секретируются различными клетками. Эти ВВ переносят биологически активные молекулы, включая белки, липиды и нуклеиновые кислоты (ДНК, мРНК, микроРНК и другие некодирующие РНК), из одной клетки в другую, что приводит к фенотипическим последствиям в клетках-реципиентах. МикроРНК (микроРНК) привлекли большое внимание из-за их роли в формировании микроокружения и в обучении клеток-реципиентов из-за их явной дисрегуляции и обилия в ВВ. Дополнительные данные указывают на то, что многие микроРНК активно загружаются в электромобили. Несмотря на эти четкие доказательства, исследования динамики экспорта и механизмов сортировки микроРНК ограничены. Здесь мы приводим протокол с использованием анализа EV-микроРНК методом проточной цитометрии, который может быть использован для понимания динамики загрузки EV-микроРНК и выявления механизмов, участвующих в экспорте микроРНК. В этом протоколе микроРНК, предварительно определенные для обогащения в ВВ и обедненные из донорских клеток, конъюгируются с флуорофором и трансфицируются в донорские клетки. Затем флуоресцентно меченные микроРНК проверяются на загрузку в ВВ и истощение клеток с помощью кОТ-ПЦР. В качестве средства контроля трансфекции и инструмента для стробирования трансфицированной популяции клеток используется флуоресцентно меченная клеточная РНК (с сохранением клеток и с истощением EV). Клетки, трансфицированные как EV-микроРНК, так и клеточной миРНК, оцениваются на флуоресцентные сигналы в течение 72 часов. Интенсивность флуоресцентного сигнала, специфичная для EV-микроРНК, быстро уменьшается по сравнению с клеточной микроРНК. Используя этот простой протокол, теперь можно оценить динамику загрузки микроРНК и определить различные факторы, ответственные за загрузку микроРНК в ВВ.

Introduction

МикроРНК (микроРНК) являются одним из наиболее хорошо охарактеризованных подмножеств малых некодирующих РНК, которые известны своей важнейшей ролью в посттранскрипционной регуляции генов. Экспрессия и биогенез большинства микроРНК следуют скоординированной серии событий, которые начинаются с транскрипции первичных микроРНК (при-миРНК) в ядре. После ядерной обработки микропроцессорным комплексом в микроРНК-предшественники (пре-микроРНК) пре-микроРНК экспортируются в цитоплазму, где подвергаются дальнейшей обработке эндонуклеазой РНКазы III, разделенной на 21-23 нуклеотидные зрелые дуплексы^{микроРНК 1}. Одна из цепей обработанной зрелой микроРНК св....

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве предварительного условия для использования этого метода требуется идентификация и валидация селективно экспортируемых микроРНК. Поскольку различные клеточные линии различаются в зависимости от груза микроРНК, отсортированного по их ВВ, рекомендуется, чтобы и?.......

Discussion

Новый протокол позволяет фиксировать кинетику высвобождения микроРНК в ВВ после трансфекции ВВ-микроРНК. Подход позволяет проводить одновременный анализ нескольких EV-микроРНК и клеточных микроРНК при условии использования возможностей цитометра. Более того, несмотря на то, что анал?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes	Fisher	05-408-129
15 mL Falcon tubes	Corning	352097
6-well clear flat bottom surface treated tissue culture plates	Fisher Scientific	FB012927
ApogeeMix 25 mL, (PS80/110/500 & Si180/240/300/590/880/1300 nm)	Apogee Flow Systems	1527	To set up gating and parameters for particle detection
Attune Nxt Flow Cytometer	ThermoFisher Scientific	N/A	For fluorescence analysis in EVs
BD Fortessa Cell Analyzer	BD Biosciences	N/A	For fluorescence analysis in cells
Cell culture incubator	N/A	N/A	Maintaining temperature of 37 °C and 5% CO2
Cell Culture medium	N/A	N/A	specific for the cell-line of interest
Cell line of interest	N/A	N/A	Any cell line tested and evaluated for EV and cellular abundance of miRNAs on interest.
Cell-miRNA (miRIDIAN microRNA Mimic Red Transfection Control)	Horizon discovery	CP-004500-01-05	miRNAs predetermined to be retained by the cell-line of interest and not selectively exported out into EVs
EV-miRNA (Fluorophore conjugated miRNAs)	Integrated DNA Technologies (IDT)		miRNAs predetermined to be selectively sorted into EVs
Fluorescence microscope	N/A	N/A
Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium	Fisher Scientific	31-985-070
Hausser Scientific Hemocytometer	Fisher	02-671-54
Hyclone 1x PBS (for cell culture)	Fisher	SH30256FS
Lipofectamine RNAimax	Fisher Scientific	13-778-150
miRCURY LNA Reverse Transcriptase	Qiagen	339340
miRCURY LNA SYBR Green PCR	Qiagen	339347
mirVana RNA Isolation	Qiagen	AM1561
Nuclease free water	Fisher Scientific	4387936
Paraformaldehyde, 4% in PBS	Fisher	AAJ61899AK
Reagent reservoir nonsterile	VWR	89094-684
Thermo ABI QuantiStudio DX Real-Time PCR	ThermoFisher Scientific	N/A
Trypsin 0.25%	Fisher	SH3004201
Ultracentrifuge	N/A	N/A