Оптимизированный метод обратной политрансфекции на основе эмбриональных стволовых клеток мыши для быстрого исследования соотношения нуклеиновых кислот

Summary

В настоящем протоколе описан метод обратной политрансфекции эмбриональных стволовых клеток мыши при культивировании средами 2i и LIF. Этот метод обеспечивает более высокую жизнеспособность и эффективность, чем традиционные протоколы прямой трансфекции, а также позволяет оптимизировать соотношение плазмид в одном горшке.

Abstract

Благодаря своей относительной простоте и легкости использования, транзиторная трансфекция клеточных линий млекопитающих нуклеиновыми кислотами стала основой биомедицинских исследований. В то время как наиболее широко используемые клеточные линии имеют надежные протоколы трансфекции в адгезивной двумерной культуре, эти протоколы часто плохо переводятся на менее изученные линии или линии с нетипичной, трудно трансфицируемой морфологией. Используя мышиные плюрипотентные стволовые клетки, выращенные в среде 2i/LIF, широко используемой модели культуры для регенеративной медицины, этот метод описывает оптимизированный, быстрый протокол обратной трансфекции, способный достичь более высокой эффективности трансфекции. Используя этот протокол, выполняется трехплазмидная политрансфекция, использующая более высокую, чем обычно, эффективность доставки плазмид для изучения расширенного диапазона стехиометрии плазмид. Этот протокол обратной политрансфекции позволяет использовать экспериментальный метод с одним горшком, что позволяет пользователям оптимизировать соотношение плазмид в одной лунке, а не в нескольких котрансфекциях. Способствуя быстрому изучению влияния стехиометрии ДНК на общую функцию доставляемых генетических цепей, этот протокол сводит к минимуму время и стоимость трансфекции эмбриональных стволовых клеток.

Introduction

Доставка ДНК и РНК в клетки млекопитающих служит основой биомедицинских^{исследований1}. Распространенным методом введения экзогенных нуклеиновых кислот (НК) в клетки млекопитающих является транзиторная трансфекция ^2,3. Этот метод основан на смешивании НК с коммерчески доступными реагентами для трансфекции, способными доставить их в клетки-реципиенты. Как правило, НК доставляется путем прямой трансфекции, при которой клетки, прилипшие к двумерной поверхности, получают трансфекционный комплекс. В то время как прямая трансфекция для наиболее распространенных установленн....

Protocol

1. Приготовление реагентов для культивирования мПСК

1. Приготовьте добавку N2.
   1. В нестерильных условиях приготовьте следующие исходные растворы (шаг 1.1.1.1) в вытяжном шкафу химической безопасности. Добавьте твердый порошок каждого химического вещества в предварительно вз.......

Discussion

Основной причиной широкого распространения протоколов трансфекции является их воспроизводимость и доступность; Тем не менее, эти протоколы требуют оптимизации в экспериментальных контекстах. Выше не упоминается стандартное тестирование, необходимое при попытке трансфекции новой к?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accutase	MilliporeSigma	SCR005
Apotransferrin	MilliporeSigma	T1147-500MG
B27 supplement	ThermoFisher Scientific	17504044
Beta-mercaptoethanol	ThermoFisher Scientific	21985023
BSA fraction V (7.5%)	Gibco	15260-037
CHIR99021	MilliporeSigma	SML1046-25MG
DMEM-F12	MilliporeSigma	D6421-24X500ML
Flow cytometry standardization beads	Spherotech	URCP-38-2K
Gelatin	MilliporeSigma	G1890
GlutaMAX supplement	ThermoFisher Scientific	35050061
Insulin	Gibco	12585-0014
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019	Transfection reagent
Neurobasal media	ThermoFisher Scientific	21103049
OptiMEM	Invitrogen	31985-070
PD0325901	MilliporeSigma	PZ0162-25MG
Progesterone	MilliporeSigma	P8783	Chemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood
Putrescine	MilliporeSigma	P6780	Chemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood
Recombinant mLIF	BioTechne	8878-LF-500/CF
Sodium selenite	MilliporeSigma	S5261-25G	Chemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood
Trypsin-EDTA	ThermoFisher Scientific	25200056