Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

В настоящем протоколе описан метод обратной политрансфекции эмбриональных стволовых клеток мыши при культивировании средами 2i и LIF. Этот метод обеспечивает более высокую жизнеспособность и эффективность, чем традиционные протоколы прямой трансфекции, а также позволяет оптимизировать соотношение плазмид в одном горшке.

Abstract

Благодаря своей относительной простоте и легкости использования, транзиторная трансфекция клеточных линий млекопитающих нуклеиновыми кислотами стала основой биомедицинских исследований. В то время как наиболее широко используемые клеточные линии имеют надежные протоколы трансфекции в адгезивной двумерной культуре, эти протоколы часто плохо переводятся на менее изученные линии или линии с нетипичной, трудно трансфицируемой морфологией. Используя мышиные плюрипотентные стволовые клетки, выращенные в среде 2i/LIF, широко используемой модели культуры для регенеративной медицины, этот метод описывает оптимизированный, быстрый протокол обратной трансфекции, способный достичь более высокой эффективности трансфекции. Используя этот протокол, выполняется трехплазмидная политрансфекция, использующая более высокую, чем обычно, эффективность доставки плазмид для изучения расширенного диапазона стехиометрии плазмид. Этот протокол обратной политрансфекции позволяет использовать экспериментальный метод с одним горшком, что позволяет пользователям оптимизировать соотношение плазмид в одной лунке, а не в нескольких котрансфекциях. Способствуя быстрому изучению влияния стехиометрии ДНК на общую функцию доставляемых генетических цепей, этот протокол сводит к минимуму время и стоимость трансфекции эмбриональных стволовых клеток.

Introduction

Доставка ДНК и РНК в клетки млекопитающих служит основой биомедицинскихисследований1. Распространенным методом введения экзогенных нуклеиновых кислот (НК) в клетки млекопитающих является транзиторная трансфекция 2,3. Этот метод основан на смешивании НК с коммерчески доступными реагентами для трансфекции, способными доставить их в клетки-реципиенты. Как правило, НК доставляется путем прямой трансфекции, при которой клетки, прилипшие к двумерной поверхности, получают трансфекционный комплекс. В то время как прямая трансфекция для наиболее распространенных установленн....

Protocol

1. Приготовление реагентов для культивирования мПСК

  1. Приготовьте добавку N2.
    1. В нестерильных условиях приготовьте следующие исходные растворы (шаг 1.1.1.1) в вытяжном шкафу химической безопасности. Добавьте твердый порошок каждого химического вещества в предварительно вз.......

Representative Results

Как прямая, так и обратная трансфекция основаны на взаимодействии между клеточной мембраной и входящими комплексами трансфекционного реагента-ДНК, что позволяет доставлять НК клеткам-реципиентам. В чем эти методы различаются, так это в состоянии клетки при доставке - в то время как ДНК.......

Discussion

Основной причиной широкого распространения протоколов трансфекции является их воспроизводимость и доступность; Тем не менее, эти протоколы требуют оптимизации в экспериментальных контекстах. Выше не упоминается стандартное тестирование, необходимое при попытке трансфекции новой к?.......

Disclosures

Авторы сообщают об отсутствии конфликта интересов.

Acknowledgements

Авторы хотели бы выразить признательность многочисленным вкладам в эту область, которые не были упомянуты в этой работе из-за нехватки места, а также финансирующим организациям, предоставившим такую возможность. Авторы выражают признательность за финансирование со стороны Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады (NSERC) и Канадского института исследований в области здравоохранения (CIHR), которые поддержали эту работу. К.М. является обладателем стипендии CGS-M от NSERC и докторской стипендии Killam от Университета Британской Колумбии. Н.С. является лауреатом премии Michael Smith Health Research BC Scholar Award.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Accutase MilliporeSigmaSCR005
Apotransferrin MilliporeSigmaT1147-500MG
B27 supplement ThermoFisher Scientific 17504044
Beta-mercaptoethanolThermoFisher Scientific 21985023
BSA fraction V (7.5%)Gibco15260-037
CHIR99021 MilliporeSigmaSML1046-25MG
DMEM-F12MilliporeSigmaD6421-24X500ML
Flow cytometry standardization beadsSpherotechURCP-38-2K
Gelatin MilliporeSigmaG1890
GlutaMAX supplement ThermoFisher Scientific 35050061
Insulin Gibco12585-0014
Lipofectamine 2000 Invitrogen11668-019Transfection reagent
Neurobasal mediaThermoFisher Scientific 21103049
OptiMEM Invitrogen31985-070
PD0325901 MilliporeSigmaPZ0162-25MG
ProgesteroneMilliporeSigmaP8783Chemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood
PutrescineMilliporeSigmaP6780Chemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood
Recombinant mLIF BioTechne8878-LF-500/CF
Sodium selenite MilliporeSigmaS5261-25GChemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood
Trypsin-EDTAThermoFisher Scientific 25200056

References

  1. Shakiba, N., Jones, R. D., Weiss, R., Del Vecchio, D. Context-aware synthetic biology by controller design: Engineering the mammalian cell. Cell Systems. 12 (6), 561-592 (2021).
  2. Fus-Kujawa, A., et al.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

202

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved