A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
В настоящем протоколе описан метод обратной политрансфекции эмбриональных стволовых клеток мыши при культивировании средами 2i и LIF. Этот метод обеспечивает более высокую жизнеспособность и эффективность, чем традиционные протоколы прямой трансфекции, а также позволяет оптимизировать соотношение плазмид в одном горшке.
Благодаря своей относительной простоте и легкости использования, транзиторная трансфекция клеточных линий млекопитающих нуклеиновыми кислотами стала основой биомедицинских исследований. В то время как наиболее широко используемые клеточные линии имеют надежные протоколы трансфекции в адгезивной двумерной культуре, эти протоколы часто плохо переводятся на менее изученные линии или линии с нетипичной, трудно трансфицируемой морфологией. Используя мышиные плюрипотентные стволовые клетки, выращенные в среде 2i/LIF, широко используемой модели культуры для регенеративной медицины, этот метод описывает оптимизированный, быстрый протокол обратной трансфекции, способный достичь более высокой эффективности трансфекции. Используя этот протокол, выполняется трехплазмидная политрансфекция, использующая более высокую, чем обычно, эффективность доставки плазмид для изучения расширенного диапазона стехиометрии плазмид. Этот протокол обратной политрансфекции позволяет использовать экспериментальный метод с одним горшком, что позволяет пользователям оптимизировать соотношение плазмид в одной лунке, а не в нескольких котрансфекциях. Способствуя быстрому изучению влияния стехиометрии ДНК на общую функцию доставляемых генетических цепей, этот протокол сводит к минимуму время и стоимость трансфекции эмбриональных стволовых клеток.
Доставка ДНК и РНК в клетки млекопитающих служит основой биомедицинскихисследований1. Распространенным методом введения экзогенных нуклеиновых кислот (НК) в клетки млекопитающих является транзиторная трансфекция 2,3. Этот метод основан на смешивании НК с коммерчески доступными реагентами для трансфекции, способными доставить их в клетки-реципиенты. Как правило, НК доставляется путем прямой трансфекции, при которой клетки, прилипшие к двумерной поверхности, получают трансфекционный комплекс. В то время как прямая трансфекция для наиболее распространенных установленн....
1. Приготовление реагентов для культивирования мПСК
Как прямая, так и обратная трансфекция основаны на взаимодействии между клеточной мембраной и входящими комплексами трансфекционного реагента-ДНК, что позволяет доставлять НК клеткам-реципиентам. В чем эти методы различаются, так это в состоянии клетки при доставке - в то время как ДНК.......
Основной причиной широкого распространения протоколов трансфекции является их воспроизводимость и доступность; Тем не менее, эти протоколы требуют оптимизации в экспериментальных контекстах. Выше не упоминается стандартное тестирование, необходимое при попытке трансфекции новой к?.......
Авторы хотели бы выразить признательность многочисленным вкладам в эту область, которые не были упомянуты в этой работе из-за нехватки места, а также финансирующим организациям, предоставившим такую возможность. Авторы выражают признательность за финансирование со стороны Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады (NSERC) и Канадского института исследований в области здравоохранения (CIHR), которые поддержали эту работу. К.М. является обладателем стипендии CGS-M от NSERC и докторской стипендии Killam от Университета Британской Колумбии. Н.С. является лауреатом премии Michael Smith Health Research BC Scholar Award.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Accutase | MilliporeSigma | SCR005 | |
Apotransferrin | MilliporeSigma | T1147-500MG | |
B27 supplement | ThermoFisher Scientific | 17504044 | |
Beta-mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | 21985023 | |
BSA fraction V (7.5%) | Gibco | 15260-037 | |
CHIR99021 | MilliporeSigma | SML1046-25MG | |
DMEM-F12 | MilliporeSigma | D6421-24X500ML | |
Flow cytometry standardization beads | Spherotech | URCP-38-2K | |
Gelatin | MilliporeSigma | G1890 | |
GlutaMAX supplement | ThermoFisher Scientific | 35050061 | |
Insulin | Gibco | 12585-0014 | |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Transfection reagent |
Neurobasal media | ThermoFisher Scientific | 21103049 | |
OptiMEM | Invitrogen | 31985-070 | |
PD0325901 | MilliporeSigma | PZ0162-25MG | |
Progesterone | MilliporeSigma | P8783 | Chemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood |
Putrescine | MilliporeSigma | P6780 | Chemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood |
Recombinant mLIF | BioTechne | 8878-LF-500/CF | |
Sodium selenite | MilliporeSigma | S5261-25G | Chemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood |
Trypsin-EDTA | ThermoFisher Scientific | 25200056 |
Explore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved