Gerando modelos de lesão retiniana em girinos Xenopus

Summary

Desenvolvemos vários protocolos para induzir dano ou degeneração retiniana em girinos de Xenopus laevis . Esses modelos oferecem a possibilidade de estudar mecanismos de regeneração retiniana.

Abstract

As doenças neurodegenerativas da retina são as principais causas de cegueira. Dentre as inúmeras estratégias terapêuticas exploradas, o estímulo à auto-reparação emergiu recentemente como particularmente atraente. Uma fonte celular de interesse para o reparo da retina é a célula glial de Müller, que abriga potencial de células-tronco e extraordinária capacidade regenerativa em anamniotas. Este potencial é, no entanto, muito limitado em mamíferos. O estudo dos mecanismos moleculares subjacentes à regeneração retiniana em modelos animais com capacidades regenerativas deve fornecer informações sobre como desbloquear a capacidade latente das células de Müller de mamíferos de regenerar a retina. Este é um passo fundamental para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas na medicina regenerativa. Para isso, desenvolvemos vários paradigmas de lesão retiniana em Xenopus: uma lesão retiniana mecânica, uma linha transgênica que permite a ablação condicional de fotorreceptores mediada por nitroredutase, um modelo de retinose pigmentar baseado em knockout de rodopsina mediado por CRISPR/Cas9 e um modelo citotóxico conduzido por injeções intraoculares de CoCl₂ . Destacando suas vantagens e desvantagens, descrevemos aqui esta série de protocolos que geram várias condições degenerativas e permitem o estudo da regeneração retiniana em Xenopus.

Introduction

Milhões de pessoas em todo o mundo são acometidas por várias doenças degenerativas da retina que levam à cegueira, como retinose pigmentar, retinopatia diabética ou degeneração macular relacionada à idade (DMRI). Até o momento, essas condições permanecem em grande parte intratáveis. As abordagens terapêuticas atuais em avaliação incluem terapia gênica, transplantes de células ou tecidos, tratamentos neuroprotetores, optogenética e dispositivos protéticos. Outra estratégia emergente baseia-se na autorregeneração por meio da ativação de células endógenas com potencial de células-tronco. As células gliais de Müller, o principal tipo de célula glial da retina, estão entre....

Protocol

Os cuidados com os animais e a experimentação foram conduzidos de acordo com as diretrizes institucionais, sob a licença institucional A91272108. Os protocolos do estudo foram aprovados pelo comitê institucional de cuidados com animais CEEA #59 e receberam autorização da Direção Départementale de la Protection des Populations sob o número de referência APAFIS #32589-2021072719047904 v4 e APAFIS #21474-2019071210549691 v2. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos .......

Discussion

Vantagens e desvantagens de vários paradigmas de lesão retiniana em girinos Xenopus

Lesão mecânica da retina
Várias lesões cirúrgicas da retina neural foram desenvolvidas em girinos de Xenopus. A retina neural pode ser totalmente removida 15,16 ou apenas parcialmente excisada ^16,17. A lesão mecânica aqui apresentad.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-Propanediol (propylène glycol)	Sigma-Aldrich	398039
Absolute ethanol ≥99.8%	VWR chemicals	20821-365
Anti-Cleaved Caspase 3 antibody (rabbit)	Cell signaling	9661S	Dilution 1/300
Anti-GFP antibody (chicken)	Aveslabs	GFP-1020	Dilution 1/500
Anti-M-Opsin antibody (rabbit)	Sigma-Aldrich	AB5405	Dilution 1/500
Anti-mouse secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat)	Invitrogen Thermo Scientific	A11005	Dilution 1/1,000
Anti-Otx2 antibody (rabbit)	Abcam	Ab183951	Dilution 1/100
Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 488 (goat)	Invitrogen Thermo Scientific	A11008	Dilution 1/1,000
Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat)	Invitrogen Thermo Scientific	A11012	Dilution 1/1,000
Anti-Recoverin antibody (rabbit)	Sigma-Aldrich	AB5585	Dilution 1/500
Anti-Rhodopsin antibody (mouse)	Sigma-Aldrich	MABN15	Dilution 1/1,000
Anti-S-Opsin antibody (rabbit)	Sigma-Aldrich	AB5407	Dilution 1/500
Apoptotis detection kit (Dead end fluorimetric TUNEL system)	Promega	G3250
Benzocaine	Sigma-Aldrich	E1501	Stock solution 10%
bisBenzimide H 33258 (Hoechst)	Sigma-Aldrich	B2883	Stock solution 10 mg/mL
Butanol-1 ≥99.5%	VWR chemicals	20810.298
Calcium chloride dihydrate (CaCl2, 2H2O)	Sigma-Aldrich (Supelco)	1.02382	Use at 0.1 M
Cas9 (EnGen Spy Cas9 NLS)	New England Biolabs	M0646T
Clark Capillary Glass model GC100TF-10	Warner Instruments (Harvard Apparatus)	30-0038
Cobalt(II) chloride hexahydrate (CoCl2, 6H2O)	Sigma-Aldrich	C8661	Stock solution 100 mM
Coverslip 24 x 60 mm	VWR	631-1575
Dako REAL ab diluent	Agilent	S202230-2
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
Electronic Rotary Microtome	Thermo Scientific	Microm HM 340E
Eosin 1% aqueous	RAL Diagnostics	312740
Fluorescein lysine dextran	Invitrogen Thermo Scientific	D1822
Fluorescent stereomicroscope	Olympus	SZX 200
Gentamycin	Euromedex	EU0410-B
Glycerin albumin acc. Mallory	Diapath	E0012	Use at 3% in water
Hematoxylin (Mayer's Hemalun)	RAL Diagnostics	320550
HEPES potassium salt	Sigma-Aldrich	H0527
Human chorionic gonadotropin hormone	MSD Animal Health	Chorulon 1500
Hydrochloric acid fuming, 37% (HCl)	Sigma-Aldrich (SAFC)	1.00314
L-Cysteine hydrochloride monohydrate	Sigma-Aldrich	C7880	Use at 2% in 0.1x MBS (pH 7.8 - 8.0)
Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4, 7H2O)	Sigma-Aldrich (Supelco)	1.05886
Metronidazole	Sigma-Aldrich (Supelco)	M3761	Use at 10 mM
Microloader tips	Eppendorf	5242956003
Micropipette puller (P-97 Flaming/Brown)	Sutter Instrument Co.	Model P-97	Program : Heat 700 / Pull 100 / Vel 75 / Time 90 / Unlocked p = 500
Mounting medium to preserve fluorescence, FluorSave Reagent	Millipore	345789
Mounting medium, Eukitt	Chem-Lab	CL04.0503.0500
MX35 Ultra Microtome blade	Epredia	3053835
Needle Agani 25 G x 5/8''	Terumo	AN*2516R1
Nickel Plated Pin Holder	Fine Science Tools	26016-12
Nylon filtration tissue (sifting fabric) NITEX, mesh opening 1,000 µm	Sefar	06-1000/44
Paraffin histowax without DMSO	Histolab	00403
Paraformaldehyde solution (32%)	Electron Microscopy Sciences	EM-15714-S	Use at 4% in 1x PBS pH 7.4
Peel-A-Way Disposable Embedding Molds	Epredia	2219
Pestle	VWR	431-0094
Petri Dish 100 mm	Corning Gosselin	SB93-101
Petri Dish 55 mm	Corning Gosselin	BP53-06
Phosphate Buffer Saline Solution (PBS) 10x	Euromedex	ET330-A
PicoSpritzer Microinjection system	Parker Instrumentation Products	PicoSpritzer III
Pins	Fine Science Tools	26002-20
Polysucrose (Ficoll PM 400 )	Sigma-Aldrich	F4375	Use at 3% in 0.1x MBS
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P3911
Powdered fry food : sera Micron Nature	sera	45475 (00720)
Scissors dissection	Fine Science Tools	14090-09
Slide Superfrost	KNITTEL Glass	VS11171076FKA
Slide warmer	Kunz instruments	HP-3
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium citrate trisodium salt dihydrate (C6H5Na3O7, 2H2O)	VWR chemicals	27833.294
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich (Supelco)	1.06329
Sodium hydroxide 30% aqueous solution (NaOH)	VWR chemicals	28217-292
Stereomicroscope	Zeiss	Stemi 2000
Syringes Omnifix-F Solo Single-use Syringes 1 mL	B-BRAUN	9161406V
trans-activating crRNA (tracrRNA)	Integrated DNA Technologies	1072533
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X-100
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416
X-Cite 200DC Fluorescence Illuminator	X-Cite	200DC
Xylene ≥98.5%	VWR chemicals	28975-325