Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט כדי לדמיין את רשתות microtubule בצמתים neuromuscular ותאי שריר. בשילוב עם הכלים הגנטיים רבי העוצמה של Drosophila melanogaster, פרוטוקול זה מקל מאוד על בדיקות גנטיות וניתוח דינמיקה של מיקרוטובולים עבור תפקידם של חלבוני ויסות רשת מיקרוטובולים במערכת העצבים.

Abstract

רשת המיקרוטובולים היא מרכיב חיוני במערכת העצבים. מוטציות בחלבוני בקרה רבים של מיקרוטובולים קשורות להפרעות נוירו-התפתחותיות ולמחלות נוירולוגיות, כגון חלבון טאו הקשור למיקרוטובולים למחלות נוירודגנרטיביות, חלבון ניתוק מיקרוטובולים ספסטין וקטנין 60 גורמים לשיתוק ספסטי תורשתי ולהפרעות נוירו-התפתחותיות, בהתאמה. זיהוי רשתות מיקרוטובולים בנוירונים הוא יתרון להבהרת הפתוגנזה של הפרעות נוירולוגיות. עם זאת, הגודל הקטן של תאי עצב והסידור הצפוף של צרורות מיקרוטובולים אקסונליים הופכים את הדמיה של רשתות המיקרוטובולים למאתגרת. במחקר זה אנו מתארים שיטה לדיסקציה של הצומת העצבית-שרירית של הזחל ותאי שריר, כמו גם צביעה חיסונית של α-טובולין וחלבון Futsch הקשור למיקרוטובול כדי לדמיין רשתות מיקרוטובולים בדרוזופילה מלנוגסטר. הצומת העצבית-שרירית מאפשרת לנו לצפות הן במיקרוטובולים קדם-סינפטיים והן לאחר סינפטיים, והגודל הגדול של תאי שריר בזחל דרוזופילה מאפשר הדמיה ברורה של רשת המיקרוטובולים. כאן, על ידי מוטציה וביטוי יתר של קטנין 60 בדרוזופילה מלנוגסטר, ולאחר מכן בחינת רשתות המיקרוטובולים בצומת העצבית-שרירית ובתאי השריר, אנו חושפים במדויק את תפקיד הבקרה של קטנין 60 בהתפתחות עצבית. לכן, בשילוב עם הכלים הגנטיים רבי העוצמה של Drosophila melanogaster, פרוטוקול זה מקל מאוד על בדיקות גנטיות וניתוח דינמיקה של מיקרוטובולים עבור תפקידם של חלבוני ויסות רשת מיקרוטובולים במערכת העצבים.

Introduction

מיקרוטובולים (MTs), כאחד המרכיבים המבניים של השלד הציטו-שלד, ממלאים תפקיד חשוב בתהליכים ביולוגיים מגוונים, כולל חלוקת תאים, גדילה ותנועתיות של תאים, הובלה תוך-תאית ושמירה על צורת התא. דינמיקה ותפקוד של מיקרוטובולים מווסתים על ידי אינטראקציות עם חלבונים אחרים, כגון MAP1, MAP2, טאו, קטנין וקינסין 1,2,3,4,5.

בנוירונים, מיקרוטובולים חיוניים להתפתחות ותחזוקה של אקסונים ודנדריטים. הפרעות במיקרוטובולים מובילות לתפקוד לקוי ואפילו למוות של נוירונים. לדוגמה, במוחם של חולי אלצהיימר, זרחן ית....

Protocol

1. דיסקציה של זחלים

הערה: תמיסת הניתוח תמיסת מלח דמוית המולימפה (HL3.1)18 ותמיסת הקיבוע 4% פרפורמלדהיד (PFA)19,20 משמשים בטמפרטורת החדר מכיוון שהמיקרוטובולים מתפרקים כאשר הטמפרטורה נמוכה מדי.

  1. בחר זחל נודד 3rd instar עם מלק.......

Representative Results

הדגמנו הליך שלב אחר שלב להדמיית רשת המיקרוטובולים הן בצמתים עצביים-שריריים (NMJs) והן בתאי שריר. לאחר דיסקציה בהתאם לתרשים הסכמטי (איור 1A-E), מתבצעת צביעה חיסונית, ולאחר מכן התמונות נצפות ונאספות תחת מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי או מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטריאוסקופי (איור 1F,G

Discussion

כאן מתואר פרוטוקול לדיסקציה וצביעה חיסונית של דרוזופילה , זחלים, צמתים עצביים-שריריים ותאי שריר. ישנן מספר נקודות חיוניות שיש לקחת בחשבון. ראשית, הימנעות מפגיעה בשרירים הנצפים היא חיונית במהלך תהליך הדיסקציה. ייתכן שכדאי לתקן את הפילה לפני הסרת איברים פנימיים כדי למנוע מגע ישיר בין ה?.......

Acknowledgements

אנו מודים לד"ר יינג שיונג על הדיונים וההערות על כתב היד. עבודה זו נתמכת על ידי מענק מהקרן הלאומית למדע של סין (NSFC) ל- C. M. (31500839).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor Plus 405 phalloidininvitrogenA30104dilute 1:200
Enhanced Antifade Mounting MediumBeyotimeP0128M
FV10-ASW confocal microscopeOlympus
Goat anti-Mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugatedThermo FisherA-11001dilute 1:1,000
Laser confocal microscope LSM 710Zeiss
Micro Scissors66vision54138B
Mouse anti-Futsch antibodyDevelopmental Studies Hybridoma Bank  22C10dilute 1:50
Mouse anti-α-tubulin antibodySigmaT5168dilute 1:1,000
ParaformaldehydeWako168-20955Final concentration: 4% in PB Buffer
Stainless Steel Minutien PinsEntomoravia0.1mm Diam
Stereomicroscope SMZ161Motic
stereoscopic fluorescence microscope BX41Olympus
Texas Red-conjugated goat anti-HRPJackson ImmunoResearchdilute 1:100
TO-PRO(R) 3 iodideInvitrogenT3605dilute 1:1,000
Transfer decoloring shaker TS-8Kylin-Bell lab instrumentsE0018
TritonX-100BioFroxx1139
Tweezers dumont500342

References

  1. Halpain, S., Dehmelt, L. The MAP1 family of microtubule-associated proteins. Genome biology. 7 (6), 224 (2006).
  2. Sánchez, C., Díaz-Nido, J., Avila, J. Phosphor....

Explore More Articles

60

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved