Usando a junção neuromuscular de larvas de Drosophila e células musculares para visualizar a rede de microtúbulos

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para visualizar as redes de microtúbulos nas junções neuromusculares e células musculares. Combinado com as poderosas ferramentas genéticas de Drosophila melanogaster, este protocolo facilita muito a triagem genética e a análise da dinâmica de microtúbulos para o papel das proteínas reguladoras da rede de microtúbulos no sistema nervoso.

Abstract

A rede de microtúbulos é um componente essencial do sistema nervoso. Mutações em muitas proteínas reguladoras dos microtúbulos estão associadas a distúrbios do neurodesenvolvimento e doenças neurológicas, tais como proteína Tau associada a microtúbulos a doenças neurodegenerativas, proteína cortadora de microtúbulos Spastin e Katanin 60 causam paraplegia espástica hereditária e anormalidades do neurodesenvolvimento, respectivamente. A detecção de redes de microtúbulos em neurônios é vantajosa para elucidar a patogênese de distúrbios neurológicos. No entanto, o pequeno tamanho dos neurônios e o arranjo denso dos feixes axonais de microtúbulos tornam a visualização das redes de microtúbulos um desafio. Neste estudo, descrevemos um método para dissecção da junção neuromuscular larval e células musculares, bem como imunomarcação de α-tubulina e proteína associada a microtúbulos Futsch para visualização de redes de microtúbulos em Drosophila melanogaster. A junção neuromuscular permite observar microtúbulos pré e pós-sinápticos, e o grande tamanho das células musculares na larva de Drosophila permite uma clara visualização da rede de microtúbulos. Aqui, ao mutar e superexpressar Katanin 60 em Drosophila melanogaster, e então examinar as redes de microtúbulos na junção neuromuscular e células musculares, revelamos com precisão o papel regulatório de Katanin 60 no neurodesenvolvimento. Portanto, combinado com as poderosas ferramentas genéticas de Drosophila melanogaster, este protocolo facilita muito a triagem genética e a análise da dinâmica de microtúbulos para o papel das proteínas reguladoras da rede de microtúbulos no sistema nervoso.

Introduction

Os microtúbulos (MTs), como um dos componentes estruturais do citoesqueleto, desempenham um papel importante em diversos processos biológicos, incluindo divisão celular, crescimento e motilidade celular, transporte intracelular e manutenção da forma celular. A dinâmica e a função dos microtúbulos são moduladas por interações com outras proteínas, como MAP1, MAP2, Tau, Katanin e Kinesin 1,2,3,4,5.

Nos neurônios, os microtúbulos são essenciais para o desenvolvimento e manutenção de....

Protocol

1. Dissecção de larvas

OBS: A solução dissecante salina hemolinf-símile (HL3.1)¹⁸ e a solução fixadora paraformaldeído (PFA) a 4%^19,20 são utilizadas à temperatura ambiente^, pois os microtúbulos se despolimerizam quando a temperatura é muito baixa.

1. Escolha uma larva errante de^3º ínstar com pinças longas e rombas. Lave-o com HL3.1 e coloque-o na placa de dissec.......

Discussion

Aqui é descrito um protocolo para a dissecção e imunomarcação de larvas de Drosophila , junções neuromusculares e células musculares. Há vários pontos essenciais a serem considerados. Em primeiro lugar, evitar a lesão dos músculos observados é crucial durante o processo de dissecção. Pode valer a pena fixar o filé antes de retirar os órgãos internos para evitar o contato direto entre a pinça e os músculos. Para evitar danos musculares ou separação da epiderme larval, é importante garantir .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor Plus 405 phalloidin	invitrogen	A30104	dilute 1:200
Enhanced Antifade Mounting Medium	Beyotime	P0128M
FV10-ASW confocal microscope	Olympus
Goat anti-Mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated	Thermo Fisher	A-11001	dilute 1:1,000
Laser confocal microscope LSM 710	Zeiss
Micro Scissors	66vision	54138B
Mouse anti-Futsch antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	22C10	dilute 1:50
Mouse anti-α-tubulin antibody	Sigma	T5168	dilute 1:1,000
Paraformaldehyde	Wako	168-20955	Final concentration: 4% in PB Buffer
Stainless Steel Minutien Pins	Entomoravia		0.1mm Diam
Stereomicroscope SMZ161	Motic
stereoscopic fluorescence microscope BX41	Olympus
Texas Red-conjugated goat anti-HRP	Jackson ImmunoResearch		dilute 1:100
TO-PRO(R) 3 iodide	Invitrogen	T3605	dilute 1:1,000
Transfer decoloring shaker TS-8	Kylin-Bell lab instruments	E0018
TritonX-100	BioFroxx	1139
Tweezers	dumont	500342