Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Здесь мы представляем подробный протокол визуализации сетей микротрубочек в нервно-мышечных соединениях и мышечных клетках. В сочетании с мощными генетическими инструментами Drosophila melanogaster, этот протокол значительно облегчает генетический скрининг и анализ динамики микротрубочек для определения роли регуляторных белков сети микротрубочек в нервной системе.

Abstract

Сеть микротрубочек является важным компонентом нервной системы. Мутации во многих регуляторных белках микротрубочек связаны с нарушениями развития нервной системы и неврологическими заболеваниями, например, микротрубочки-ассоциированный белок Tau с нейродегенеративными заболеваниями, расщепляющий микротрубочки белок Spastin и Katanin 60 вызывают наследственную спастическую параплегию и аномалии развития нервной системы, соответственно. Обнаружение сетей микротрубочек в нейронах полезно для выяснения патогенеза неврологических расстройств. Однако небольшой размер нейронов и плотное расположение пучков аксональных микротрубочек затрудняют визуализацию сетей микротрубочек. В данной работе мы описываем метод рассечения нервно-мышечного соединения личинок и мышечных клеток, а также иммуноокрашивание α-тубулина и микротрубочно-ассоциированного белка Futsch для визуализации сетей микротрубочек у Drosophila melanogaster. Нервно-мышечное соединение позволяет нам наблюдать как пре-, так и постсинаптические микротрубочки, а большой размер мышечных клеток у личинки дрозофилы позволяет четко визуализировать сеть микротрубочек. Здесь, мутируя и гиперэкспрессируя катанин 60 у Drosophila melanogaster, а затем исследуя сети микротрубочек в нервно-мышечном соединении и мышечных клетках, мы точно выявляем регуляторную роль катанина 60 в развитии нервной системы. Таким образом, в сочетании с мощными генетическими инструментами Drosophila melanogaster, этот протокол значительно облегчает генетический скрининг и анализ динамики микротрубочек на предмет роли регуляторных белков сети микротрубочек в нервной системе.

Introduction

Микротрубочки (МТ), как один из структурных компонентов цитоскелета, играют важную роль в различных биологических процессах, включая деление клеток, рост и подвижность клеток, внутриклеточный транспорт и поддержание формы клеток. Динамика и функция микротрубочек модулируются взаимодействием с другими белками, такими как MAP1, MAP2, Tau, Katanin и Kinesin 1,2,3,4,5.

В нейронах микротрубочки необходимы для развития и поддержания аксонов и дендритов. Аномалии в микротрубочках привод....

Protocol

1. Вскрытие личинок

ПРИМЕЧАНИЕ: Рассекающий раствор гемолимфоподобного физиологического раствора (HL3.1)18 и фиксирующий раствор 4% параформальдегида (PFA)19,20 используются при комнатной температуре, поскольку микротрубочк.......

Representative Results

Мы продемонстрировали пошаговую процедуру визуализации сети микротрубочек как в нервно-мышечных соединениях (NMJ), так и в мышечных клетках. После вскрытия в соответствии с принципиальной схемой (рис. 1A-E) проводится иммуноокрашивание, после чего изображения наблюдаются и собир.......

Discussion

Здесь описан протокол вскрытия и иммуноокрашивания нервно-мышечных соединений личинок дрозофилы и мышечных клеток. Есть несколько важных моментов, которые следует учитывать. Во-первых, во время процесса рассечения очень важно избежать травмирования наблюдаемых мышц. Возможно, с?.......

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

Мы благодарим д-ра Ин Сюна за обсуждение и комментарии к рукописи. Эта работа поддержана грантом Национального научного фонда Китая (NSFC) C. M. (31500839).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor Plus 405 phalloidininvitrogenA30104dilute 1:200
Enhanced Antifade Mounting MediumBeyotimeP0128M
FV10-ASW confocal microscopeOlympus
Goat anti-Mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugatedThermo FisherA-11001dilute 1:1,000
Laser confocal microscope LSM 710Zeiss
Micro Scissors66vision54138B
Mouse anti-Futsch antibodyDevelopmental Studies Hybridoma Bank  22C10dilute 1:50
Mouse anti-α-tubulin antibodySigmaT5168dilute 1:1,000
ParaformaldehydeWako168-20955Final concentration: 4% in PB Buffer
Stainless Steel Minutien PinsEntomoravia0.1mm Diam
Stereomicroscope SMZ161Motic
stereoscopic fluorescence microscope BX41Olympus
Texas Red-conjugated goat anti-HRPJackson ImmunoResearchdilute 1:100
TO-PRO(R) 3 iodideInvitrogenT3605dilute 1:1,000
Transfer decoloring shaker TS-8Kylin-Bell lab instrumentsE0018
TritonX-100BioFroxx1139
Tweezers dumont500342

References

  1. Halpain, S., Dehmelt, L. The MAP1 family of microtubule-associated proteins. Genome biology. 7 (6), 224 (2006).
  2. Sánchez, C., Díaz-Nido, J., Avila, J. Phosphor....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

60

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved