Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Здесь мы представляем подробный протокол визуализации сетей микротрубочек в нервно-мышечных соединениях и мышечных клетках. В сочетании с мощными генетическими инструментами Drosophila melanogaster, этот протокол значительно облегчает генетический скрининг и анализ динамики микротрубочек для определения роли регуляторных белков сети микротрубочек в нервной системе.

Abstract

Сеть микротрубочек является важным компонентом нервной системы. Мутации во многих регуляторных белках микротрубочек связаны с нарушениями развития нервной системы и неврологическими заболеваниями, например, микротрубочки-ассоциированный белок Tau с нейродегенеративными заболеваниями, расщепляющий микротрубочки белок Spastin и Katanin 60 вызывают наследственную спастическую параплегию и аномалии развития нервной системы, соответственно. Обнаружение сетей микротрубочек в нейронах полезно для выяснения патогенеза неврологических расстройств. Однако небольшой размер нейронов и плотное расположение пучков аксональных микротрубочек затрудняют визуализацию сетей микротрубочек. В данной работе мы описываем метод рассечения нервно-мышечного соединения личинок и мышечных клеток, а также иммуноокрашивание α-тубулина и микротрубочно-ассоциированного белка Futsch для визуализации сетей микротрубочек у Drosophila melanogaster. Нервно-мышечное соединение позволяет нам наблюдать как пре-, так и постсинаптические микротрубочки, а большой размер мышечных клеток у личинки дрозофилы позволяет четко визуализировать сеть микротрубочек. Здесь, мутируя и гиперэкспрессируя катанин 60 у Drosophila melanogaster, а затем исследуя сети микротрубочек в нервно-мышечном соединении и мышечных клетках, мы точно выявляем регуляторную роль катанина 60 в развитии нервной системы. Таким образом, в сочетании с мощными генетическими инструментами Drosophila melanogaster, этот протокол значительно облегчает генетический скрининг и анализ динамики микротрубочек на предмет роли регуляторных белков сети микротрубочек в нервной системе.

Introduction

Микротрубочки (МТ), как один из структурных компонентов цитоскелета, играют важную роль в различных биологических процессах, включая деление клеток, рост и подвижность клеток, внутриклеточный транспорт и поддержание формы клеток. Динамика и функция микротрубочек модулируются взаимодействием с другими белками, такими как MAP1, MAP2, Tau, Katanin и Kinesin 1,2,3,4,5.

В нейронах микротрубочки необходимы для развития и поддержания аксонов и дендритов. Аномалии в микротрубочках привод....

Protocol

1. Вскрытие личинок

ПРИМЕЧАНИЕ: Рассекающий раствор гемолимфоподобного физиологического раствора (HL3.1)18 и фиксирующий раствор 4% параформальдегида (PFA)19,20 используются при комнатной температуре, поскольку микротрубочк.......

Representative Results

Мы продемонстрировали пошаговую процедуру визуализации сети микротрубочек как в нервно-мышечных соединениях (NMJ), так и в мышечных клетках. После вскрытия в соответствии с принципиальной схемой (рис. 1A-E) проводится иммуноокрашивание, после чего изображения наблюдаются и собир.......

Discussion

Здесь описан протокол вскрытия и иммуноокрашивания нервно-мышечных соединений личинок дрозофилы и мышечных клеток. Есть несколько важных моментов, которые следует учитывать. Во-первых, во время процесса рассечения очень важно избежать травмирования наблюдаемых мышц. Возможно, с?.......

Acknowledgements

Мы благодарим д-ра Ин Сюна за обсуждение и комментарии к рукописи. Эта работа поддержана грантом Национального научного фонда Китая (NSFC) C. M. (31500839).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor Plus 405 phalloidininvitrogenA30104dilute 1:200
Enhanced Antifade Mounting MediumBeyotimeP0128M
FV10-ASW confocal microscopeOlympus
Goat anti-Mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugatedThermo FisherA-11001dilute 1:1,000
Laser confocal microscope LSM 710Zeiss
Micro Scissors66vision54138B
Mouse anti-Futsch antibodyDevelopmental Studies Hybridoma Bank  22C10dilute 1:50
Mouse anti-α-tubulin antibodySigmaT5168dilute 1:1,000
ParaformaldehydeWako168-20955Final concentration: 4% in PB Buffer
Stainless Steel Minutien PinsEntomoravia0.1mm Diam
Stereomicroscope SMZ161Motic
stereoscopic fluorescence microscope BX41Olympus
Texas Red-conjugated goat anti-HRPJackson ImmunoResearchdilute 1:100
TO-PRO(R) 3 iodideInvitrogenT3605dilute 1:1,000
Transfer decoloring shaker TS-8Kylin-Bell lab instrumentsE0018
TritonX-100BioFroxx1139
Tweezers dumont500342

References

  1. Halpain, S., Dehmelt, L. The MAP1 family of microtubule-associated proteins. Genome biology. 7 (6), 224 (2006).
  2. Sánchez, C., Díaz-Nido, J., Avila, J. Phosphor....

Explore More Articles

60

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved