A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Здесь мы представляем подробный протокол визуализации сетей микротрубочек в нервно-мышечных соединениях и мышечных клетках. В сочетании с мощными генетическими инструментами Drosophila melanogaster, этот протокол значительно облегчает генетический скрининг и анализ динамики микротрубочек для определения роли регуляторных белков сети микротрубочек в нервной системе.
Сеть микротрубочек является важным компонентом нервной системы. Мутации во многих регуляторных белках микротрубочек связаны с нарушениями развития нервной системы и неврологическими заболеваниями, например, микротрубочки-ассоциированный белок Tau с нейродегенеративными заболеваниями, расщепляющий микротрубочки белок Spastin и Katanin 60 вызывают наследственную спастическую параплегию и аномалии развития нервной системы, соответственно. Обнаружение сетей микротрубочек в нейронах полезно для выяснения патогенеза неврологических расстройств. Однако небольшой размер нейронов и плотное расположение пучков аксональных микротрубочек затрудняют визуализацию сетей микротрубочек. В данной работе мы описываем метод рассечения нервно-мышечного соединения личинок и мышечных клеток, а также иммуноокрашивание α-тубулина и микротрубочно-ассоциированного белка Futsch для визуализации сетей микротрубочек у Drosophila melanogaster. Нервно-мышечное соединение позволяет нам наблюдать как пре-, так и постсинаптические микротрубочки, а большой размер мышечных клеток у личинки дрозофилы позволяет четко визуализировать сеть микротрубочек. Здесь, мутируя и гиперэкспрессируя катанин 60 у Drosophila melanogaster, а затем исследуя сети микротрубочек в нервно-мышечном соединении и мышечных клетках, мы точно выявляем регуляторную роль катанина 60 в развитии нервной системы. Таким образом, в сочетании с мощными генетическими инструментами Drosophila melanogaster, этот протокол значительно облегчает генетический скрининг и анализ динамики микротрубочек на предмет роли регуляторных белков сети микротрубочек в нервной системе.
Микротрубочки (МТ), как один из структурных компонентов цитоскелета, играют важную роль в различных биологических процессах, включая деление клеток, рост и подвижность клеток, внутриклеточный транспорт и поддержание формы клеток. Динамика и функция микротрубочек модулируются взаимодействием с другими белками, такими как MAP1, MAP2, Tau, Katanin и Kinesin 1,2,3,4,5.
В нейронах микротрубочки необходимы для развития и поддержания аксонов и дендритов. Аномалии в микротрубочках привод....
1. Вскрытие личинок
ПРИМЕЧАНИЕ: Рассекающий раствор гемолимфоподобного физиологического раствора (HL3.1)18 и фиксирующий раствор 4% параформальдегида (PFA)19,20 используются при комнатной температуре, поскольку микротрубочк.......
Мы продемонстрировали пошаговую процедуру визуализации сети микротрубочек как в нервно-мышечных соединениях (NMJ), так и в мышечных клетках. После вскрытия в соответствии с принципиальной схемой (рис. 1A-E) проводится иммуноокрашивание, после чего изображения наблюдаются и собир.......
Здесь описан протокол вскрытия и иммуноокрашивания нервно-мышечных соединений личинок дрозофилы и мышечных клеток. Есть несколько важных моментов, которые следует учитывать. Во-первых, во время процесса рассечения очень важно избежать травмирования наблюдаемых мышц. Возможно, с?.......
Мы благодарим д-ра Ин Сюна за обсуждение и комментарии к рукописи. Эта работа поддержана грантом Национального научного фонда Китая (NSFC) C. M. (31500839).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Alexa Fluor Plus 405 phalloidin | invitrogen | A30104 | dilute 1:200 |
Enhanced Antifade Mounting Medium | Beyotime | P0128M | |
FV10-ASW confocal microscope | Olympus | ||
Goat anti-Mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated | Thermo Fisher | A-11001 | dilute 1:1,000 |
Laser confocal microscope LSM 710 | Zeiss | ||
Micro Scissors | 66vision | 54138B | |
Mouse anti-Futsch antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 22C10 | dilute 1:50 |
Mouse anti-α-tubulin antibody | Sigma | T5168 | dilute 1:1,000 |
Paraformaldehyde | Wako | 168-20955 | Final concentration: 4% in PB Buffer |
Stainless Steel Minutien Pins | Entomoravia | 0.1mm Diam | |
Stereomicroscope SMZ161 | Motic | ||
stereoscopic fluorescence microscope BX41 | Olympus | ||
Texas Red-conjugated goat anti-HRP | Jackson ImmunoResearch | dilute 1:100 | |
TO-PRO(R) 3 iodide | Invitrogen | T3605 | dilute 1:1,000 |
Transfer decoloring shaker TS-8 | Kylin-Bell lab instruments | E0018 | |
TritonX-100 | BioFroxx | 1139 | |
Tweezers | dumont | 500342 |
Explore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved