Metodologia per inattivare metabolicamente i batteri per la ricerca su Caenorhabditis elegans

Summary

La fonte di cibo per Caenorhabditis elegans in laboratorio è l'Escherichia coli vivo. Poiché i batteri sono metabolicamente attivi, presentano una variabile confondente negli studi metabolici e farmacologici in C. elegans. Un protocollo dettagliato per inattivare metabolicamente i batteri utilizzando la paraformaldeide è descritto qui.

Abstract

Caenorhabditis elegans è un organismo modello comune per la ricerca in genetica, sviluppo, invecchiamento, metabolismo e comportamento. Poiché i C. elegans consumano una dieta a base di batteri vivi, l'attività metabolica della loro fonte di cibo può confondere gli esperimenti che cercano gli effetti diretti di vari interventi sul verme. Per evitare gli effetti confondenti del metabolismo batterico, i ricercatori di C. elegans hanno utilizzato diversi metodi per inattivare metabolicamente i batteri, tra cui l'irradiazione ultravioletta (UV), l'uccisione del calore e gli antibiotici. Il trattamento UV è relativamente a bassa produttività e non può essere utilizzato in coltura liquida perché ogni piastra deve essere esaminata per verificare il successo dell'abbattimento batterico. Un secondo metodo di trattamento, l'uccisione termica, influisce negativamente sulla consistenza e sulla qualità nutrizionale dei batteri, portando all'arresto dello sviluppo di C. elegans. Infine, il trattamento antibiotico può alterare direttamente la fisiologia di C. elegans oltre a prevenire la crescita batterica. Questo manoscritto descrive un metodo alternativo per inattivare metabolicamente i batteri utilizzando la paraformaldeide (PFA). Il trattamento con PFA lega in modo incrociato le proteine all'interno delle cellule batteriche per prevenire l'attività metabolica preservando la struttura cellulare e il contenuto nutrizionale. Questo metodo è ad alta produttività e può essere utilizzato in coltura liquida o in piastre solide, poiché l'analisi della crescita di una piastra di batteri trattati con PFA convalida l'intero lotto. L'inattivazione metabolica attraverso il trattamento con PFA può essere utilizzata per eliminare gli effetti confondenti del metabolismo batterico sugli studi sull'integrazione di farmaci o metaboliti, sulla resistenza allo stress, sulla metabolomica e sul comportamento in C. elegans.

Introduction

Caenorhabditis elegans è stato originariamente proposto come organismo modello nel 1965¹ e da allora è stato ampiamente adottato negli studi di genetica, sviluppo, comportamento, invecchiamento e metabolismo². Grazie alle grandi dimensioni della covata e alla cuticola trasparente, C. elegans è particolarmente adatto per lo screening ad alto rendimento con reporter fluorescenti³. Il loro breve ciclo di vita, la riproduzione ermafrodita e l'omologia genetica con l'uomo rendono C. elegans un prezioso sistema modello per gli studi sullo sviluppo⁴ e su....

Protocol

1. Inoculazione di batteri

1. Preparare il brodo Luria (LB) sciogliendo 10 g di triptone, 5 g di estratto di lievito e 10 g di cloruro di sodio (NaCl) in 950 ml di acqua distillata.
2. Regolare il pH del LB a 7,0 aggiungendo idrossido di sodio (NaOH) 5M. Questo dovrebbe richiedere solo circa 0,2 mL di NaOH.
3. Sterilizzare in autoclave il terreno LB a pH regolato su un ciclo liquido per 45 minuti a 15 psi. Lasciare raffreddare la soluzione e conservarla a temperatura ambiente.
.......

Discussion

Vantaggi dell'uccisione dei PFA rispetto ad altri metodi di uccisione batterica
Il trattamento con PFA è un metodo ad alto rendimento per prevenire il metabolismo batterico mantenendo una fonte di cibo nutriente per C. elegans. L'uccisione dei batteri tramite il trattamento PFA presenta molteplici vantaggi rispetto ad altri metodi. A differenza del trattamento UV, in cui ogni piastra deve essere testata per il successo dell'uccisione, una singola piastra di un lotto di batteri trattati con P.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aluminum Foil	Staples	2549291
Bunsen burner	VWR	470121-700
Cell Density Meter	Denville	80-3000-45
Centrifuge	Eppendorg	5430
Chemical fume hood	Labcono	975050411384RG
Conincal tubes (50 mL)	Fisher	339652
Cuvettes	Fisher	14-955-127
E. coli OP50	CGC	OP50
Erlenmyer flasks	Fisher	250 mL: FB501250 500 mL: FB501500 1000 mL: FB5011000
Inoculation loop	Fisher	22-363-605
LB Agar	Fisher	BP1425500
Liquid waste collection bottle	Thomas Scientific	1230G50
Magnesium Sulfate (MgSO4)	Sigma	M7506
Paraformaldehyde (32%)	Electron Microscopy Sciences	15714-S	Paraformaldehyde – methanol free solution
Pipettor	Eppendorf	Eppendorf Easypet 3
Plastic dishes (100 mm)	Fisher	FB0875712
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)	Fisher	P2853
Seahorse XF Calibrant	Agilent	100840-000
Seahorse XFe96 Extracellular Flux Assay Kit and Cell Culture Microplate	Agilent	101085-004
Serological pipettes (50 mL)	Genesee Scientific	12-107
Shaker incubator	Thermo	11 676 083
Sodium Chloride (NaCl)	Fisher	S640-3
Sodium Hydroxide (NaOH)	Fisher	S318500
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Na2HPO4)	Sigma	S374-500
Solid waste collection bucket	M&M Industries	5.0 Gallon M1 Traditional Pail
Tryptone	Genesee Scientific	20-251
Vortex	Thermo	11676331
Weighing balance	C Goldenwall	HZ10K6B
Yeast Extract	Genesee Scientific	20-255