שיטת הניקור התרמופלסמוני משלבת מיקרוסקופ קונפוקלי, פינצטה אופטית וננו-חלקיקי זהב כדי לחקור תגובות חלבונים במהלך תיקון קרום פלזמה בתאים ובועיות חד-למלריות ענקיות. הטכניקה מאפשרת ניקוב מהיר ומקומי של הממברנה, ומאפשרת זיהוי חלבוני מפתח ותפקידם הפונקציונלי במנגנון המורכב לתיקון קרום הפלזמה.
קרום התא חיוני להישרדות התא, והבטחת שלמותו חיונית מכיוון שהתא חווה פציעות לאורך כל מחזור חייו. כדי למנוע נזק לממברנה, התאים פיתחו מנגנוני תיקון יעילים של קרום הפלזמה. ניתן לחקור מנגנוני תיקון אלה על ידי שילוב של מיקרוסקופ קונפוקלי ותרמופלסמוניקה ננומטרית כדי לזהות ולחקור את תפקידם של חלבוני מפתח, כגון נספחים, המעורבים בתיקון פני השטח בתאים חיים ובמערכות מודל ממברנה.
שיטת הניקוב משתמשת בלייזר כדי לגרום לחימום מקומי מאוד על קרינת ננו-חלקיקים. השימוש באור אינפרא אדום קרוב ממזער את הפוטוטוקסיות בדגימה הביולוגית, בעוד שרוב הבליעה מתרחשת בננו-חלקיק פלסמוני תהודה קרוב לאינפרא אדום. שיטה תרמופלסמונית זו נוצלה למחקר פוטותרמי וביופיזי פוטנציאלי כדי לשפר את ההבנה של מנגנונים תוך-תאיים ותגובות תאיות באמצעות מחקרי שלפוחית ואיחוי תאים. הגישה הוכחה כמשלימה לשיטות קיימות לשיבוש הממברנה, כגון פציעות המושרות באופן מכני, כימי או אופטי, ומספקת רמה גבוהה של שליטה על ידי גרימת פציעות מקומיות ביותר. היקף הפגיעה מוגבל לקרבת הננו-חלקיק הכדורי, ולא מתרחש נזק מזיק לאורך נתיב הקרן בניגוד ללייזרים פועמים באורכי גל שונים. למרות מגבלות מסוימות, כגון היווצרות ננו-בועות, השיטה התרמופלסמונית מציעה כלי ייחודי לחקר תגובות תאיות בתיקון קרום פלזמה בסביבה כמעט טבעית מבלי לפגוע בכדאיות התא.
בשילוב עם מיקרוסקופיה קונפוקלית, שיטת הניקור יכולה לספק הבנה מכניסטית של דינמיקת הממברנות במערכות ממברנות מודל, כמו גם מידע כמותי על תגובות חלבונים לנזק לממברנה, כולל גיוס חלבונים ותפקודם הביופיזי. בסך הכל, היישום של שיטה זו במערכות מודל מופחתות יכול לשפר את הבנתנו את המנגנון המורכב לתיקון קרום פלזמה בתאים חיים.
קרום התא, המשמש הן כמחסום פיזי והן כפלטפורמת איתות, חיוני להישרדות התא1. לאורך כל מחזור התא שלה, קרום הפלזמה (PM) נתון לנזקים, כגון פציעות מכניות 2,3,4,5 וכימיות6 הנגרמות על ידי מתח. כדי לשמור על שלמות הממברנה ולהבטיח את הישרדות התא, התא פיתח מנגנוני תיקון קרום פלזמה (PMR) חזקים. מנגנונים אלה תלויים באסטרטגיות שונות, כגון ארגון מחדש של שלד ציטו-שלד, איחוי ממברנות ואסטרטגיות החלפת ממברנות 7,8,9,10,11, שכולן מסתמכות על גיוס חלבונים ספציפיים. יש לציין כי בני משפחת חלבוני האנקסין זוהו כחלבוני מפתח הקשורים לתהליכים של PMR 1,9,12,13,14,15,16. בעקבות פגיעה בחומר חלקיקי, התא חווה זרם של יוני סידן (Ca2+), המהווים איום מיידי על הישרדות התא17. בתגובה לשטף Ca2+, חלבוני אנקסין, הממוקמים בעיקר בציטוזול, נקשרים לעלון הפנימי של קרום הפלזמה הפגוע כחלק מאסטרטגיות PMR18. Annexin A2 (ANXA2) היה אחד החברים הראשונים במשפחת האנקטין שנקשר ל-PMR במחלת ניוון שרירים חסר דיספרלין, והוצע כי הוא מתווך תיקון על ידי איחוי שלפוחיות תוך-תאיות ל-PM ליד אתר הפציעה 5,19,20,21. לאחר מכן, מספר תפקידים יוחסו לנספחים22, ותפקידם ב-PMR זכה לתשומת לב מוגברת ב-20 השנים האחרונות. עם זאת, תפקידם המדויק של הנספחים ב-PMR עדיין אינו מובן במלואו 15,18,21,22.
מאמר זה מציע שיטה לחקר אינטראקציה חלבון-ממברנה ודינמיקה של ממברנות באופן מבוקר ומקומי מאוד, תוך שימוש בשילוב של מיקרוסקופיה קונפוקלית, פינצטה אופטית וננו-חלקיקי זהב (AuNPs). שיטה זו מאפשרת מחקר כמותי של אינטראקציות חלבון, שומנים ומולקולות קטנות בתגובה לנזק לממברנה וזרם Ca2+ . למרות המורכבות והריבוי של המרכיבים המעורבים בתהליך תיקון הממברנה, מערכות ממברנות פשוטות המחקות את קרום הפלזמה שימשו להשגת הבנה מכניסטית עמוקה יותר של דינמיקת הממברנה והתגובה של חלבוני אנקסין לשיבוש הממברנה16. שלפוחיות שומנים חד-למלריות ענקיות (GUVs) נבחרו כמערכת קרום המודל עם הרכב שומנים מוגדר. ה-GUVs נוצרו בשיטת הידרציה בעזרת ג'ל, במיוחד הידרציה של ג'ל אלכוהול פוליוויניל, כפי שתואר על ידי Weinberger et al.23, שאפשרה אנקפסולציה יעילה של נספחים לתוך GUVs.
השימוש בקרינת לייזר אינפרא-אדום קרוב (NIR) על ננו-חלקיקים מתכתיים (NPs) גורם לחימום משמעותי של NP, מה שהופך אותו לשיטה יעילה להקמת מקור חום מקומי המנוצל ביישומים ביו-רפואיים24. השיטה שימשה בתחילה למדידה ישירה של הטמפרטורה סביב AuNP יחיד הן בבדיקות ביומימטיות דו-ממדיות והן תלת-ממדיות. בבדיקות אלה25,26, הננו-חלקיקים הפלזמוניים הוקרנו על דו-שכבה ליפידית נתמכת או נלכדו אופטית ליד GUV שעברו מעבר פאזה תרמית מקומית בחימום מקומי, מה שאיפשר כימות ובקרה של פרופיל הטמפרטורה המדויק סביב החלקיק. פרופיל טמפרטורת ייחוס זה שימש בעת חקירה או מניפולציה של דגימות ביולוגיות. התקדמות נוספת בשיטה הקלה על השראת נקבוביות ננוסקופיות בממברנות27, ואפשרה איחוי שלפוחית ואיחוי תאים28,29. מחקרים אחרים חקרו את ההתנהגות של חלבוני קרום היקפי בחלבוני GUVs29 וחלבונים טרנסממברנליים30 על ידי יצירת בועיות היברידיות חדשניות, בעוד שהעברת תרופות ספציפיות לתאים נחקרה גם כדי לשלוט ולחקור תגובות תאיות או ביטוי גנים 28,29,31,32,33. לאחרונה נעשה שימוש בשיטה כדי לחקור תגובות חלבונים לנזק לממברנות 32,34,35.
קיימות מספר שיטות לשיבוש קרום הפלזמה כדי לחקור תגובות תאיות ותיקון ממברנה. אלה כוללים ניקובי מיקרו-מחטים, טלטול מיקרו-חרוזים וגירוד תאים, שכולם יכולים לשבש את קרום התא באופן מכני 14,36,37. נזק כימי יכול להיות מושג על ידי הוספת דטרגנטים 5,38 או רעלנים חיידקיים39,40 המערערים את יציבות השומנים הדו-שכבתיים ויוצרים נקבוביות קרום על פני קרום הפלזמה. יתר על כן, פציעות המושרות אופטית על ידי גלים רציפים ולייזרים פועמים שימשו לחקר רכיבי PMR, כגון חלבוני אנקסין 5,14,21,41, בשילוב עם ננו-חלקיקים פלסמוניים 42,43,44,45 . למרות יעילותם של לייזרים פועמים בהספק גבוה, הם עלולים לגרום לפציעות משמעותיות ולנזק לפנים התא לאורך נתיב הקרן. יתר על כן, השינויים המפורטים המתרחשים בחומר הביולוגי בעת הקרנת לייזר פועמת והאם היא יוצרת נקבובית מוגדרת היטב עדיין צריכים להיחקר. במאמר זה מוצגת שיטה חלופית, המשתמשת בתרמופלזמוניקה כדי לגרום לחורים ננוסקופיים בחומר חלקיקי באופן מבוקר34,35 מבלי לגרום נזק משמעותי למבנים הפנימיים. זה מושג על ידי חשיפת NPs פלסמוניים ללייזר NIR ממוקד מאוד, וכתוצאה מכך עליית טמפרטורה מקומית מאוד שיכולה להגיע בקלות לטמפרטורות העולות על 200 מעלות צלזיוס, מה שיכול להוביל לפיצוצים ננוסקופיים קטנים 25,46,47. ניתן לשלוט בתהליך זה על ידי התאמת עוצמת הלייזר, כמו גם הגודל, הצורה וההרכב של NPs48. על ידי שימוש בטכניקה זו, חוקרים יכולים לחקור את תפקידם של חלבונים בתיקון חלקיקים חלקיקיים בתאים חיים, מה שיכול לעזור לענות על כמה מהשאלות הבלתי פתורות לגבי מעורבותם של חלבוני אנקסין בתיקון ממברנות מבלי לפגוע בכדאיות התא.
הלכידה האופטית של ננו-חלקיקים פלסמוניים הוכחה היטב על ידי מחקרים קודמים 25,49,50,51,52; עם זאת, תובנות נוספות לגבי התכונות התרמופלסמוניות של ננו-חלקיקים 53,54,55 ניתן לקבל בחומרים המשלימים (קובץ משלים 1). השיטה התרמופלסמונית יכולה לשמש ליצירת חורים ננוסקופיים בחומר חלקיקי לצורך חקר התגובה התאית ומנגנוני התיקון. ליתר דיוק, הנקב יכול להיות מושג באמצעות חימום אופטי של AuNPs בקרבת הממברנה, כפי שמוצג באיורים 1A ו-B. ניקוב מקומי זה מאפשר זרם Ca2+, שאומת על ידי חיישן סידן, ובכך מפעיל את מנגנון PMR. עבור ניסויים בתאים חיים, AuNPs בקוטר של 200 ננומטר שותקו על פני השטח מתחת לתא כדי לפקח על התפקיד של ANXA2 ב- PMR באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. לייזר NIR (איור 1A,B), באורך גל של 1064 ננומטר, מקרין את ה-AuNP ומנצל את התכונות הפלזמוניות שלו (איור 1C), וכתוצאה מכך חימום מקומי משמעותי (איור 1D) בחלון השקיפות הביולוגית49 תוך גרימת נזק מינימלי לתא עצמו. אזור הטמפרטורה הגבוהה המקיף את ה-AuNP יורד במהירות ב-30-40% במרחק המתאים לרדיוס ה-NP, כפי שמתואר באיור 1E, מה שמאפשר פגיעה מוגבלת מאוד בכל שלושת המימדים.
קובץ משלים 1. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
איור 1: קווי מתאר סכמטיים של שיטת הניסוי. (A) תאים נגועים ב-ANXA ממוקמים על גבי ננו-חלקיקי זהב משותקים (AuNPs) על פני השטח, או (B) שלפוחיות חד-למלריות ענקיות (GUVs) עם ANXA עטוף תלויות בתווך המכיל AuNPs. (C) AuNP יחיד מוקרן על-ידי מלכודת אופטית NIR, שבה האינטראקציה בין השדה האלקטרומגנטי הנכנס לבין אלקטרונים מוליכים מובילה לתנודה קולקטיבית של אלקטרונים בתוך NP. (D) תהליך זה גורם לעלייה מוגבלת מאוד אך משמעותית בטמפרטורה. כדי להעריך את הטמפרטורה על פני השטח NP, משתמשים בתורת Mie, ומחושב פרופיל טמפרטורה (E) עבור AuNP בקוטר של 200 ננומטר ועוצמת לייזר I = 6.36 x 108 W/cm2. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
כדי למזער את ההשפעה התרמית על קרום התא, AuNPs מוקרנים רק למשך ~ שנייה אחת. זה גורם לפרץ חום חולף ומקומי, אשר מפחית את הנזק לחלבונים שבדרך כלל דורשים זמן רב יותר כדי להתפתח. עם ניקוב הממברנה, חלבוני אנקסין מגויסים תוך שבריר שנייה, ותוך מספר שניות נוצר פיגום דמוי טבעת אנקסין סביב אתר הפציעה (איור 2). גישה זו יושמה גם כדי לחקור את המעורבות של ANXA5 הן בתאים חיים והן בקרומי מודל16 במאמץ לשפוך אור על התוכנית המלאה של תהליכי התיקון. בעוד שההתמקדות העיקרית הייתה בגיוס מתאם של חלבוני אנקסין שונים, ההיבטים הביופיזיקליים של מנגנון התיקון טרם הובהרו.
כדי ליישם באופן מלא את השיטה המוצעת, נדרשים שלושה מרכיבים מרכזיים: מיקרוסקופ קונפוקלי, פינצטה אופטית וננו-חלקיקי מתכת. פינצטה אופטית משמשת ללכידת AuNPs, ואת הבנייה שלהם ניתן להשיג על ידי ביצוע ההליך שתואר על ידי Neuman et al.49. עם זאת, אם בניית פינצטה אופטית מתגלה כמאתגרת מדי, ניתן להשתמש בלייזר NIR ממוקד היטב כדי להקרין AuNPs משותקים מתחת לתאים. בעוד AuNPs כדוריים נבחרו עבור פרוטוקול זה, מגוון של חלקיקים פלסמוניים עם ספקטרום בליעה teven יכול לשמש גם כדי להשיג שיפוע טמפרטורה מקומי מאוד בתוך אזור NIR48.
הדמיה פלואורסצנטית נחוצה לצפייה בתפקידם של החלבונים המסומנים באופן פלואורסצנטי, ולכן מיקרוסקופ השתקפות פנימי כולל (TIRF)56 יכול להיחשב כחלופה לדימות קונפוקלי. עם זאת, טכניקה זו מאפשרת רק הדמיה של פני השטח ולא תהיה תואמת לניסויי שלפוחית הממברנה של המודל. כתוצאה מכך, הן הפינצטה האופטית והן המיקרוסקופ הקונפוקלי חיוניים למיקום מדויק של הננו-חלקיק ולחקירה מפורטת של האזור המקומי הסובב את הפגיעה בתא. כדי להקרין ביעילות את הננו-חלקיק עם מיקוד לייזר מוגבל עקיפה, יש צורך לדמיין את הננו-חלקיק. ניתן להשיג זאת בצורה אופטימלית על ידי מיקרוסקופ השתקפות, שהוא תכונת הדמיה סטנדרטית של מיקרוסקופים קונפוקליים של לייקה. עם זאת, אם הדמיית השתקפות או פיזור אינה זמינה, ניתן לשקול שיטות חלופיות, כגון תיוג AuNP פלואורסצנטי פחות יעיל.
לסיכום, לשיטה התרמופלסמונית הנשלטת והמקומית המוצגת במחקר זה יש פוטנציאל לשמש פלטפורמה מצוינת לחקר המרכיבים המולקולריים המעורבים בתגובות תאיות ובמנגנוני תיקון חלקיקים בתאים חיים. בנוסף לחקר תגובת החלבון על נזקי PM ניתן להשתמש בגישה זו גם לניקוב מקומי של שלפוחיות, ובכך לאפשר חקירה של תגובת החלבון הן בדינמיקה של חלבון-חלבון והן בדינמיקה של חלבון-ממברנה. יתר על כן, שיטה זו מאפשרת ניתוח כמותי של יחסי הגומלין בין חלבונים, שומנים ומולקולות קטנות כאשר ממברנות משובשות. באופן קולקטיבי, להתקדמות זו יש פוטנציאל לשפוך אור על כמה מהשאלות הבלתי פתורות בנוגע למכונות המורכבות והמורכבות לתיקון קרום פלזמה.
1. הכנת ניקוב קרום התא
2. ניסוי ניקוב קרום התא
מידע משלים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
3. הכנת שלפוחית חד-למלרית ענקית (GUV)
4. ניסוי ניקוב GUV
טבלה 1: טבלה לקביעת הרכב GUV. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
5. מדידות וניתוח נתונים של תגובת ANXA בניסויי ניקוב תאים
במחקר הנוכחי, השיטה התרמופלסמונית משמשת לחקר תגובת חלבון האנקסין להפרעה בקרום הפלזמה; עם זאת, כל חלבון שניתן לגייס עם פגיעה בממברנה יכול להיחקר באמצעות בדיקה זו, בהתחשב בכך שהחלבון המתאים מסומן באופן פלואורסצנטי. גיוס חלבונים ותפקודם מנוטרים על ידי הדמיה קונפוקלית הן בתאי כליות עובריות אנושיות (HEK293T) והן בשלפוחיות חד-למלריות ענקיות (GUV). כדי לפרט, איור 2 מדגים את תנאי הניסוי שבהם קרן לייזר NIR ממוקדת ב-1064 ננומטר משמשת להקרנת AuNP יחיד (איור 2A), מה שגורם לפגיעה בקרום ולזרימה של Ca2+ לתוך התא, מה שמפעיל את מנגנון PMR. לאחר מכן, נספחים מגויסים במהירות לאתר הפגיעה, שם הם נקשרים לפוספוליפידים הטעונים שלילית בהיקף הפצע, ויוצרים מבנה דמוי טבעת תוך שניות (איור 2B, i-iv). ניסויי קרום המודל, באמצעות GUVs, הראו כי נקבי הממברנה נאטמו מחדש במהירות בהיעדר ANXA, כפי שמתואר באיור 2C. אולם בנוכחות ANXA נצפתה הצטברות מהירה של ANXA באתר הפציעה לאחר ניקוב הממברנה (איור 2D). יש לציין כי ANXA המשיכה לגלגל את הקצוות החשופים, מה שהוביל בסופו של דבר להתפוצצות ה- GUV. מנגנון גלגול זה נובע ככל הנראה מהיכולת של ANXA לגרום לעקמומיות ולכופף את קרומי השומנים20.
איור 2: תגובת Annexins (ANXAs) להפרעה בקרום המושרה על-ידי תרמופלסמוניק. בתחילה, (A) קרום הפלזמה פועל כמחסום בין הסביבה החוץ תאית המכילה רמות גבוהות של יוני Ca2+ לבין הסביבה התוך-תאית עם ANXA עטופים. עם הקרנה בלייזר אינפרא אדום קרוב (NIR), ה- AuNP מייצר חום משמעותי, גורם לקרום להיקרע וכתוצאה מכך זרם של יוני Ca2+. כתוצאה מכך, מכונות תיקון קרום פלזמה (PMR) מופעל, אשר כרוך גיוס של ANXAs לאתר הפציעה, שם הם נקשרים פוספוליפידים טעונים שלילית. (ב-ד) תמונות מיקרוסקופ קונפוקלי של תא המכיל ANXA2 ו- GUV המכיל ANXA4 מדגימות תהליך זה. (i) לפני הקרינה, התמונות מראות תא שלם, או GUV, כאשר אתרי ההקרנה מסומנים בחצים הלבנים. (ii) עם הקרנת ננו-חלקיקים, (B) ANXA מגויסים במהירות לאתר הפגיעה, ויוצרים מבנה דמוי טבעת סביב פצע הממברנה (B [ii-iv]). לוח (C) מראה GUV מוכתם בקרום ללא ANXA, אשר, עם ניקוב, אוטם מחדש במהירות ללא עיצוב מחדש של הממברנה שניתן לראות. מצד שני, לוח (D) מראה GUV המכיל ANXA4 רקומביננטי, שכבר קשור לממברנה לפני (i) הקרנה עקב דליפת Ca2+ על פני הממברנה. (ii) עם הניקוב, ANXA4 נקשר לקצוות החופשיים, מה שגורם ל-GUV לקרוס כאשר הממברנה מתגלגלת הרחק מהקצה. מוטות קנה המידה הם 10 מיקרומטר עבור איור (B), 2 מיקרומטר עבור B (i), 10 מיקרומטר עבור (C) ו-15 מיקרומטר עבור (D). נתון זה משוכפל מ Moreno-Pescador et. al16 באישור החברה המלכותית לכימיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
ניתוח של מבנים שלמים דמויי טבעת ANXA (איור 2B ואיור משלים 1) מספק תובנות שימושיות לגבי גודל הפצע והמורפולוגיה. רדיוס מבנה טבעת ANXA יכול להיקבע על פני זמן ומרחב, כמתואר בסעיף 5. מורנו ועמיתיו ניתחו יותר מ-135 פגיעות בקרום הפלזמה בתאים חיים, כאשר הניתוח של מבנים טבעתיים מסוג ANXA5 מתואר באיור 3. הרדיוס נקבע על-ידי מדידת המרחק ממרכז הטבעת לרדיוס החיצוני של העקומה בהתבסס על חצי הרוחב המלא של פרופיל העוצמה שהתמוטט (איור 3A). הממצאים הדגימו התפלגות הטרוגנית של גדלי טבעות ANXA5 (איור 3B), שנשארה קבועה לאורך זמן (איור 3D,G,H) ומרחב (איור 3C,E,F). תוצאות אלה מצביעות על הצטברות של ANXA5 סביב אתרי הפגיעה, דבר המצביע על אסטרטגיית PMR חלופית בתיווך ANXA5 בתאים חיים לניצנים הפנימיים דמויי המשפך המשוערים של הממברנההפגועה 5.
איור 3: ניתוח מבנים טבעתיים של ANXA5 המקיפים אתר פגיעה בתאים חיים. (A) הייצוג הסכמטי ממחיש את הגישה האנליטית, המבוססת על חצי רוחב מקסימלי של פרופיל קו עוצמת ANXA. (B) ההיסטוגרמה מדגימה 135 רדיוסי טבעת ANXA5 שנמדדו. (C) פרופילי קו עוצמת פלואורסצנטיות על פני טבעת ANXA5-GFP עבור כל חתך z של ערימת z. (D) התמונות הקונפוקליות ממחישות את התפתחות הזמן של פצע, כאשר ANXA5-GFP מצטבר בהיקף הפצע מיד לאחר הפציעה, ואחריו ייצוב הפצע. מסגרות הזמן שסומנו 1-6 צולמו במרווחים של 0.66 שניות לכל מסגרת. סרגל קנה המידה הוא 2 מיקרומטר. (E) רדיוסי הפצעים נקבעו כפונקציה של עומק הפצע בהתבסס על השיטה שהוצגה בלוח A. (F) שיפוע הפצע נותח כרדיוסי טבעת ANXA5 כפונקציה של גובה z בהתבסס על הנתונים שחולצו מלוח E. (G) פרופילי קו עוצמת הפלואורסצנטיות נמדדו על פני טבעת ANXA5-GFP מלוח D, כאשר בכל מרווח זמן 1-6 מסומן כפרוסה 1-6. לבסוף, (H) התפתחות הזמן של רדיוסי טבעת ANXA5-GFP מוצגת כפונקציה של הזמן המחושב מהנתונים בלוח G. נתון זה משוכפל מ Moreno-Pescador et. al16 באישור החברה המלכותית לכימיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
בהשוואה למבנים דמויי טבעת שנוצרים על-ידי הפרעה לחומר חלקיקי בלבד (איור משלים 1), פציעות בקרבת הגרעין (איור משלים 2A) עשויות להשפיע על האבולוציה והגיאומטריה של הפצע. מדי פעם, רק חלק קטן של טבעות ANXA היו ברורים (איור משלים 2B,C), אשר ניתן לנתח גם באמצעות זרימת העבודה הפנימית של ניתוח MATLAB (ראה סעיף 5), אם כי נתונים נוספים עשויים ללכת לאיבוד. בדרך כלל, תצורות טבעות ANXA שנצפו בתאים לא נצמדים (איור משלים 2C) ממוקמות קרוב הן לגרעין והן לפריפריה של התא. כתוצאה מכך, מבנה טבעת מוארך יותר ניתן לצפות, אשר אינו אופטימלי עבור ניתוח הנתונים המוצגים. בנוסף, תאים שאינם דבקים נראו רגישים יותר למוות תאי בעקבות פציעה של חומר חלקיקי. יתר על כן, כאשר בוחנים פציעות הנובעות מהקרנה של אגרגטים AuNP, חשוב לציין כי פציעות אלה עשויות להיות חמורות יותר ופחות ניתנות לשליטה. זאת בשל הגידול המשמעותי בחימום פלסמוני, אשר יכול לפגוע בחלק גדול של התא. כתוצאה מכך, פציעות כאלה לא שולבו בניתוח טבעת ANXA5.
יתר על כן, הממצאים הראשוניים מצביעים על כך שההפרעה בקרום הפלזמה באמצעות תרמופלזמוניקה גורמת לרמות גבוהות של Ca2+ תוך תאי. זה נצפה אפילו בקרינה בעוצמה נמוכה של AuNPs בודדים, מה שמרמז על חדירות PM35, כפי שמתואר באיור 4. זרם Ca2+ נצפה בתאים המבטאים בדיקת סידן קשורה לקרום, GCaMP6s-CAAX, אשר עוברת שינוי קונפורמציה עם זרם Ca2+ , ולכן ניתן לראות עלייה בעוצמתו64. עוצמת הסידן כומתה עבור כל טביעת הרגל של התא לאורך זמן. כדי למנוע רעשי רקע, רמת Ca2+ ברקע הופחתה לפני הפרעה בממברנה ותיקון לאחר הממברנה. העוצמה המרבית נקבעה על-ידי נרמול העוצמה הממוצעת של Ca2+ בתוך התא, וכתוצאה מכך עקומת העוצמה הציגה עלייה ראשונית מהירה בעוצמה של Ca2+ ואחריה ירידה איטית יותר, כפי שמתואר באיור 4B.
התא הגיע לעוצמת סידן מקסימלית של ~ 6.6 שניות, מה שעולה בקנה אחד עם ממצאיהם של Klenow et al.64, שהציעו כי זמן שיא עוצמת הסידן (t = tc) מתאים לזמן הדרוש לסגירת פצע. עם זאת, בעוד שנדרשות חקירות נוספות כדי לבסס את המנגנון הבסיסי של תיקון קרום וריפוי פצעים, הממצאים הראשוניים הראו כי תהליך Ca2+ זה נצפה אך ורק בתא הפגוע ולא בתא שלא נפגע המשמש כבקרה חיובית. זה מאשר כי התא חווה זרם Ca2+ על הפרעה בקרום thermoplasmonic, שבו עודף סידן תוך תאי נשאב באופן פעיל החוצה לאחר PMR מוצלח כמו רמת הסידן התאית כבר לא בתחרות עם זרם Ca2+ , בסופו של דבר להשיג הומאוסטטזיסהתא 64.
איור 4: זרימת סידן מתרחשת כאשר קרום הפלזמה של תא HEK293T נקרע על-ידי תרמופלזמוניקה. סדרה של תמונות קונפוקליות מראות שני תאים (התא המעניין ותא שלא נפגע המשמש כבקרה חיובית) המבטאים את בדיקת הסידן הקשורה לקרום, GCaMP6s-CAAX. סרגל קנה המידה מודד 10 מיקרומטר. (A) לפני הקרינה, בשעה 00:00 שניות, טביעת הרגל של שני התאים מודגשת על-ידי הקו האפור המקווקו, ואתר ההקרנה מסומן בעיגול הצהוב. עם הקרנת לייזר, זרם מהיר של Ca2+ הוא ציין, להגיע לעוצמה מקסימלית ב ~ 6.6 שניות, מסומן על ידי קו מקווקו כתום, נקודת זמן כי הוא הניח להתאים את הזמן של סגירת הפצע64. (B) פרופיל עוצמת הסידן שהתקבל מבדיקת GCaMP6s-CAAX בתא הפגוע (קו כחול) הושווה לעוצמת Ca2+ בתא שכן שלא נפגע (קו מקווקו אפור), והראה זרימה ברורה של Ca2+ אך ורק עם הפרעה ל-PM. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
המחקר מדגיש את הגישה התרמופלסמונית כטכניקה מבטיחה לחקר תגובות חלבונים בתאים חיים ומודל ממברנות לאחר הפרעה בממברנה. שיטה זו לא רק מספקת מידע נרחב על גיוס חלבונים, אלא גם על התפקוד הביופיזיקלי של חלבונים המעורבים בדינמיקה של חלבון-ממברנה. כתוצאה מכך, הוא מאפשר זיהוי של רכיבים מולקולריים האחראים לתיקון פני השטח ומקדם את ההבנה של המנגנון המורכב אך חיוני של תיקון קרום פלזמה. למרות שקיימות שיטות שונות לגרימת שיבוש בממברנה, כגון טכניקות מכניות, כימיות ואופטיות, שיטות אלה סובלות ממגבלות, כגון היותן לא ספציפיות לתאים, יוצרות פגיעות מרובות בקרום התא, או גורמות נזק משמעותי לממברנה ובוערות חומר תאי פנימי לאורך נתיב הלייזר בעת שימוש בלייזרים פועמים בעוצמה גבוהה. בעוד שהשילוב של מיקרוסקופ קונפוקלי ופינצטה אופטית מציע את המידע המקיף ביותר, ניתן להשתמש גם בשיטות הדמיה חלופיות. לדוגמה, מכיוון שההדמיה של ננו-חלקיק פלסמוני מושגת באמצעות מיקרוסקופ השתקפות, מצב הדמיה מובנה במיקרוסקופ קונפוקלי של לייקה, ניתן להשתמש בטכניקות הדמיה נוספות, כגון מיקרוסקופ שדה כהה65,66, שיטות פיזור אחרות כמו iSCAT67,68, או תיוג פלואורסצנטי של הננו-חלקיק, להדמיית AuNP, אם כי הדבר עשוי להגביל את תחולת השיטה.
השיטה המוצגת מסוגלת גם לגרום לחורים ננוסקופיים בקרומי המודל, ומאפשרת לחקור את השפעות הסינרגיה בין נספחים שונים. זה מושג על ידי עטיפת נספחים רקומביננטיים בעלי תווית שונה, למשל, RFP ו- GFP, בהתאמה, ולאחר מכן ניקוב תרמופלסמוני. מערכת מודל זו מספקת תובנה לגבי האופן שבו נספחים מתקשרים עם ממברנות בקרבת קצוות חופשיים, כפי שמודגם באיור 2D. עם זאת, שלא כמו בתאים, החורים הנגרמים על GUV ממשיכים להתרחב, ואחריו ערעור היציבות של השלפוחית. הדמיה של התפתחות החור באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי יכולה להיות מאתגרת בשל ההתרחבות המהירה של קוטר החור, אך ניתן להשיג אותה על ידי לכידת מספר ערימות z לאורך זמן. שיטה חלופית תהיה להשתמש בדיסק מסתובב קונפוקלי להדמיה מהירה יותר. יתר על כן, הגישה התרמופלסמונית מניבה בדרך כלל מספר מוגבל של תוצאות אופטימליות בשעה כאשר היא מיושמת על תאים בודדים או ניסויי GUV, בדרך כלל שניים עד שלושה, בטמפרטורות מדגם בין 20 ° C ל 30 ° C. כדי לקבל את התצפית המדויקת ביותר על דינמיקה של חלבון-ממברנה, מומלץ לשמור את התאים במאגר המכיל HEPES ולהחליף את הדגימה מדי שעה. לחלופין, ניתן להרחיב את חלון הניסוי על ידי ביצוע הניסויים בתא דגירה של התא, כלומר בטמפרטורה קבועה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2. יתר על כן, שילוב גישה זו עם טכניקות הדמיה אחרות, כגון מיקרוסקופ שחזור אופטי סטוכסטי (STORM), יכול לספק הבנה עמוקה יותר של הפונקציה הביופיזית והאינטראקציה של חלבוני מפתח המעורבים בתיקון ממברנות ברמת מולקולה יחידה. זה יכול לספק מידע מפורט על אתר הפציעה, כולל גיאומטריית הפצע והמיקום של חלבוני אנקסין, כמו גם לזהות שחקני מפתח אחרים המעורבים בתיקון פני השטח של הממברנה.
על מנת להשיג יעילות ודיוק מרביים בגרימת פגיעה בממברנה, חובה לוודא את מיקום מוקד הלייזר לפני כל ניסוי ולוודא כי המיקום הצירי של מוקד הלייזר עולה בקנה אחד עם המיקוד הקונפוקלי. יישור זה מייעל את העוצמה במהלך הדמיית AuNP, מה שמוביל לעליית טמפרטורה מקומית מקסימלית וכתוצאה מכך לפגיעה בקרום בעוצמת לייזר נמוכה יותר. תהליך זה מבוצע באופן ידני ולכן רגיש לשונות ביעילות הקרע של הממברנה, שכן המיקוד מתורגם ידנית למיקום החופף למיקום החלקיק. במיקרוסקופים חסרי מצב השתקפות, כמו במערכות מסחריות מסוימות, לוקליזציה משותפת של מיקוד הלייזר והחלקיק יכולה להיות מאתגרת. במקרים כאלה, ניתן להשתמש במצבי הדמיה חלופיים (למשל, שדה בהיר), וניתן לבצע סריקת רסטר איטית סביב מיקום החלקיקים הצפוי. יש לציין כי עוצמת לייזר נמוכה עשויה לגרום לחדירת הממברנה בלבד, בעוד שעוצמת לייזר גבוהה יכולה ליצור טמפרטורות סביב NP העולות על נקודת הרתיחה של המים, גם אם משטח הזכוכית הוא בעל אפקט קירור. ההערכה היא כי היווצרות ננו-בועות סביב NPs מתרחשת בין 200 ° C ל 300 ° C25,48, כאשר החום הנפיץ עלול לגרום לתזוזה של חלקיקים ממוקד הלייזר או לפיצול חלקיקים. בנוסף, היווצרות ננו או מיקרו-בועות במהלך חימום מציבה אתגר לשיטה זו. מכיוון שממשקי אוויר מרטיבים את הממברנות ועלולים לגרום לערעור יציבות החלבון, דבר שאינו רצוי, חובה להגביל את החימום כאשר חוקרים תיקון ממברנה. יש לציין כי ננו-קליפות זהב אינן סובלות מטמפרטורות גבוהות והן יתפרקו בתנאים אלה, כפי שמודגם במיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה58.
מאמר זה מספק פרוטוקול מפורט לשימוש בתרמופלזמוניקה לביצוע נקבים מקומיים מאוד בממברנות, אשר ישים הן לתאים והן לקרומי מודל. כדי להפחית עוד יותר את היקף החימום, ניתן להשתמש בננו-חלקיקים קטנים יותר בעלי תהודה לאור NIR, המאפשרים נקבים תוך-תאיים באנדוזומים, ברשתית האנדופלסמית ובמעטפת הגרעין. ננו-חלקיקים כאלה, כולל מוטות וננו-מטריושקות48, יכולים לשמש לחקר תיקון מעטפת גרעינית על ידי התמקדות בננו-חלקיקי זהב אנדוציטוזים הנקלטים בקלות על פני התא ונסחרים לעבר גרעין69. באופן כללי, טכניקה זו מאפשרת זיהוי ובחינה של מרכיבים מולקולריים מרכזיים המעורבים ב-PMR, תוך הבהרת תפקודם ותפקידם הביופיזיקלי תוך שמירה על יכולת הקיום של התאים.
ברצוננו להודות ל-Jesper Nylandsted על שסיפק לנו חלבוני אנקסין רקומביננטיים ופלסמידים המקודדים עבור נספחים. עבודה זו נתמכה כספית על ידי המועצה הדנית למחקר עצמאי, מדעי הטבע (DFF-4181-00196), על ידי תוכנית הסינרגיה הבין-תחומית של קרן נובו נורדיסק 2018 (NNF18OC0034936), הוועדה המדעית של האגודה הדנית לסרטן (R90-A5847-14-S2), קרן לונדבק (R218-2016-534), ועל ידי מרכז המצוינות של קרן לונדבק (Biomembranes in Nanomedicine).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1064 nm trapping laser | Spectra Physics | N/A | Spectra Physics J201-BL-106C, Nd: YVO4 NIR laser |
160 nm Gold Nanoshells | NanoComposix | NCXGSIR150 | |
200 nm Gold Nanoparticles | BBI Solutions | EM.GC200/7 | |
35 mm glass surface MatTex microwell | MATTEK | P35G-1.5-14-C | |
Amber-glass vials | Supelco Sigma Aldrich | 243438 | |
Annexin A2 plasmids | N/A | N/A | Received from our collaborator at the Danish Cancer Research Center |
Annexin A4 recombinant-protein | N/A | N/A | N-terminal GFP tagged ANXA4 received from our collaborator at the Danish Cancer Research Center |
Annexin A5 recombinant-protein | N/A | N/A | N-terminal GFP tagged ANXA5 received from our collaborator at the Danish Cancer Research Center |
beta-casein | Sigma Life Science | C6905-1G | |
CaCl2 | Suprlco (sigma Aldrich) | 10035-04-8 | |
Centrifuge 5702 | Eppendorf | 5702 | |
Chloroform | VWR Chemicals | 67-66-3 | |
Culture dish (Nunclon Delta Surface) | Thermo scientific | 150460 | |
DID cell-labelling Solution | Invitrogen | 7757 | |
Distilled water | Gibco | 15230-089 | |
DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375C | Dissolved in chloroform |
DOPS | Avanti Polar Lipids | 840035C | Dissolved in chloroform |
Dulbecco's Modified Eage's Medium | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
FIJI ImageJ distribution | ImageJ2 | N/A | |
GCaMP6s-CAAX | N/A | Received from our collaborator at the Danish Cancer Research Center | |
Gibco Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 11573397 | 10% of the culture medium |
Glucose | PROLABO | 24 374.297 | |
Hamilton syringes | Hamilton Company | N/A | 50 and 500 microliters |
Harrick Plasma Cleaner PDG-002 | Harrick Plasma | N/A | |
HEK293T cells | N/A | Received from our collaborator at the Danish Cancer Research Center | |
Leica Acousto-Optical Beam Splitter (AOBS) | Leica | N/A | |
Leica PL APO 63x water immersion objective, NA = 1.2 | Leica | N/A | |
Leica SP5 confocal scanning microscope | Leica | N/A | |
Lipofectamine | Fisher Scientific | 15338030 | |
MatLab | The Mathworks, Inc., Natick, Massachusetts, United States | N/A | |
NaCl | VWR Chemicals | 7647-14-5 | |
Opti-MEM Reduced-Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | |
Parafilm | Bemis | PM-992 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 1% of the culture medium |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
Piezoelectric stage (PI 731.20) | Physik Instrumente (Germany) | N/A | |
Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich | P8920-100ML | 0.01-0.1% for coating |
Polyvinyl alcohol | Sigma-Aldrich | 363065-25G | |
round glass slide 25 mm Ø | VWR | 631-1584 | |
Sonicator Brandson 2800 | Brandson | N/A | |
sucrose | Sigma Life Science | 57-50-1 | |
T25 tissue culture flask | Falcon | 353108 | Blue Vented cap |
Tris-HCl | Invitrogen | 15567-027 | |
TrypLE | Thermo Fisher Scientific | A1285901 | |
Trypsin-EDTA | Fisher Scientific | 11590626 | |
VWR Mixer mini vortex 230V EU | VWR | 12620-84 | ECN: 444-2790, SN: 150713022 |
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved