森林蛀木虫昆虫病原真菌的分离、行为鉴定和致病性评估

Summary

在这里，我们提出了一种从森林蛀木虫中获取昆虫病原真菌的方案，以及一种使用鞘翅目模式昆虫评估其昆虫病原活性的替代方法。该方法高效、方便地从天然林的蛀木害虫中探寻昆虫病原真菌资源。

Abstract

森林蛀木虫 （FWB） 在世界范围内造成严重的树木破坏和经济损失。在 FWB 出现期间释放昆虫病原真菌 （EPF） 被认为是化学控制的可接受替代方案。然而，与农业害虫相比，FWB 的 EPF 资源勘探明显较少。本文以野生 Monochamus alternatus 种群为例，提出了一种从 FWB 中探索 EPF 资源的方案。在这个协议中，分配了以 M 为诱饵的陷阱。在甲虫的出现期间，对不同种群的 Alternatus 引诱剂保证了收集到足够的具有自然感染症状的样本。在精细解剖外皮并将其放在选择性培养基上后，从甲虫身体的每个部分分离出真菌物种，并根据分子和形态特征进行鉴定。

几种真菌物种通过用孢子悬浮液重新感染健康的 M. alternatus 被证明为寄生 EPFs。使用扫描电子显微镜观察它们在 M. alternatus 上的行为表型，并进一步与鞘翅目模式昆虫 Tribolium castaneum 上的行为表型进行比较。对于在两种甲虫物种上表现出一致寄生表型的 EPF，评估它们在 T 上的活性。 castaneum 为未来对 M. alternatus 的研究提供了有关致死率的宝贵信息。该方案有助于发现中国新报道的 M. alternatus 种群的 EPF，可作为一种有效的方法，从其他 FWB 中探索更多的 EPF 资源。

Introduction

害虫造成的破坏给森林和农业生态系统造成了巨大的生态和经济损失。大多数农业害虫在损害寄主植物的同时，将自己暴露在天敌或人工控制剂中。相反，森林蛀木虫 （FWB） 几乎在寄主树干¹ 内完成其整个发育周期，这为在野外探索 FWB 的有效生防生物提出了巨大挑战。更糟糕的是，FWB 携带大量植物病原体² 或与这些病原体密切相关，因为它们的潜在载体 ^3,4，大大放大了 FWB 对森林健康的负面影响。过量使用化学杀虫剂可以减轻 FWB 的严重程度，但杀虫剂耐药性的出现 ^5,6 限制了它们在环境中的应用。在某些情况下，昆虫寄生虫、捕食性节肢动物以及昆虫病原微生物作为生物防治剂被释放到 FWB⁷ 的分布区域，并被证明是化学防治的有效且经济上可接受的替代品 ^8,9,10。

Protocol

1. 从 M. alternatus 中分离真菌（图 1）

1. 采集甲虫样本
   1. 收集松树锯木甲虫 M。在自然感染的松树林中，使用商业诱捕器（见材料表）以诱饵诱饵的 alternatus 甲虫种群。
      注：本研究从华南地区的五个地理区域（湖州/浙江、凉山/四川、厦门/福建、韶关/广东、玉林/广西）收集了甲虫.......

Discussion

由于 EPF 物种对当地气候因素和寄主昆虫的特定基因型种群的长期环境适应，FWB 的不同地理种群可能与天然昆虫病原真菌发生不同的相互作用^44,45。正如先前对农业害虫的研究所描述的那样，将采样点扩展到多个昆虫发生区域有助于增加从其自然宿主获得不同菌株或种类的 EPF 的可能性⁴⁶。在该协议中，在以引?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL, 2 mL centrifuge tubes	Biosharp	BS-15-M
10 µL pipet tips	Sangon Biotech	F601216
10 µL, 20 µL, 100 µL, 200 µL, 1,000 µL pipettes	Rainin
1,000 µL pipet tips	Sangon Biotech	F630102
2 mL cryogenic vials	Corning	430659
20x PBS buffer	Sangon Biotech	B548117-0500
200 µL pipet tips	Sangon Biotech	F601227
2,000 bp maker	TaKaRar	SD0531
50 mL tubes	Nest	602052
50% glutaraldehyde solution	Sangon Biotech	G916054
50x TAE buffer	Sangon Biotech	B548101
6x loading buffer	TaKaRar	SD0503
Agarose	Sangon Biotech	A610013
Anhydrous ethanol	Jkchemical	LB10V37
Biochemistry Cultivation Cabinet	Shanghaiyiheng	LRH-250F
Chloroform	Juhua	61553
Commercial beetle traps	FEIMENGDI	BF-8	www.yinyouji.com
Gel imager	Bio-Rad	GelDoc XR+
Glycerol	Sangon Biotech	A600232
High speed refrigerated centrifuge	Sigma	D-37520
High-Pressure Steam Sterilization Pot	Mettler Toledo	JA5003
Isopropyl alcohol	General-reagent	G75885B
Nucleic acid dye	Sangon Biotech	A616696
Optical Microscope, OM	Leica	DM2000
Parafilm	Parafilm	PM996
PCR meter	Heal Force	Trident960
Penicillin G	Marklin	GB15743
Potato dextrose agar, PDA	Oxoid	CM0139
Potato dextrose broth, PDB	Solarbio	P9240
Primers	Sangon Biotech	/
Primers Taq	TaKaRar	RR902A
Rapid Fungi Genomic DNA Isolation Kit	Sangon Biotech	B518229
Scanning Electron Microscope, SEM	Hitachi	S-3400N
Streptomycin	Marklin	S6153
Tetracycline	Marklin	T829835
Tween-80	Marklin	T6336
Vacuum freeze dryer	Yamato	DC801
Vortex Shaker	HLD	WH-861
β-Mercaptoethanol	Marklin	M6230