בידוד, זיהוי התנהגותי והערכת פתוגניות של פטריות אנטומופתוגניות מבורר עצים ביער

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול לקבלת פטריות אנטומופתוגניות מבורר עצים ביער ודרך חלופית להעריך את פעילותן האנטומופתוגנית באמצעות חרק מודל קולאופטרן. שיטה זו יעילה ונוחה לחקר משאבים פטרייתיים אנטומופתוגניים ממזיקים חרקים משעממי עץ ביערות טבעיים.

Abstract

בורות עץ יער (FWB) גורמים לנזק חמור לעצים ולהפסדים כלכליים ברחבי העולם. שחרור פטריות אנטומופתוגניות (EPF) במהלך תקופת הופעת FWB נחשב חלופה מקובלת לבקרה כימית. עם זאת, משאבי EPF נחקרו פחות באופן משמעותי עבור FWBs, בניגוד למזיקים חרקים חקלאיים. מאמר זה מציג פרוטוקול לחקר משאבי EPF מ-FWBs תוך שימוש באוכלוסיות בר Monochamus alternatus כדוגמה. בפרוטוקול זה, הקצאת מלכודות פיתיון עם M. אלטרנטוס המושך לאוכלוסיות שונות הבטיח איסוף דגימות נאותות עם תסמיני זיהום טבעיים, בתקופות הופעתה של החיפושית. לאחר ניתוח דק של אינטגמנטים והצבתם על תווך סלקטיבי, בודדו מיני פטריות מכל חלק בגופי החיפושיות וזוהו על סמך תכונות מולקולריות ומורפולוגיות כאחד.

מספר מינים פטרייתיים אושרו כ-EPFs טפיליים באמצעות הדבקה חוזרת של M. alternatus בריא עם תרחיף נבגים. הפנוטיפים ההתנהגותיים שלהם על M. alternatus נצפו באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק והושוו עוד יותר לאלה על חרק מודל Coleopteran Tribolium castaneum. עבור EPFs המציגים פנוטיפים עקביים של טפילות על שני מיני החיפושיות, הערכת פעילותם על T. קסטנאום סיפק מידע רב ערך על קטלניות למחקר עתידי על M. alternatus. פרוטוקול זה סייע לגילוי EPF שדווח לאחרונה על אוכלוסיות M. alternatus בסין, אשר יכול להיות מיושם כגישה יעילה לחקור יותר משאבי EPF מ- FWB אחרים.

Introduction

ההרס שנגרם על ידי מזיקים חרקים הוביל להפסדים אקולוגיים וכלכליים גדולים הן במערכות אקולוגיות יער והן במערכות אקולוגיות חקלאיות. רוב המזיקים החקלאיים חושפים את עצמם לאויבים טבעיים או לחומרי הדברה מלאכותיים תוך פגיעה בצמחים פונדקאים. במקום זאת, בורות עץ יער (FWB) כמעט משלימים את כל מחזורי ההתפתחות שלהם בתוך גזעי עצים מארחים¹, מה שמעלה אתגרים גדולים לחקור אורגניזמים יעילים של הדברה ביולוגית מ-FWB בשדה הפראי. מה שגרוע עוד יותר הוא ש-FWBs נושאים מספר רב של פיטופתוגנים² או שיש להם מערכת יחסים אינטימית עם פתוגנים אלה כווקטורים פוטנציאליים ^3,4,....

Protocol

1. בידוד פטריות מ-M. alternatus (איור 1)

1. אספו את דגימת החיפושית
   1. לאסוף את אורנים sawyer חיפושיות M. אלטרנטוס משתמש במלכודות מסחריות (ראו טבלת חומרים) שאותן פיתו מושכים לפני תקופות הופעתן החזויות של אוכלוסיות החיפוש?.......

Discussion

אוכלוסיות גיאוגרפיות שונות של FWB עשויות לפתח אינטראקציות מגוונות עם הפטריות האנטומופתוגניות הטבעיות, עקב התאמה סביבתית ארוכת טווח של מיני EPF לגורמי אקלים מקומיים ולאוכלוסייה הגנוטיפית הספציפית של החרק המארח^44,45. הרחבת אתרי הדגימה לאזורי .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL, 2 mL centrifuge tubes	Biosharp	BS-15-M
10 µL pipet tips	Sangon Biotech	F601216
10 µL, 20 µL, 100 µL, 200 µL, 1,000 µL pipettes	Rainin
1,000 µL pipet tips	Sangon Biotech	F630102
2 mL cryogenic vials	Corning	430659
20x PBS buffer	Sangon Biotech	B548117-0500
200 µL pipet tips	Sangon Biotech	F601227
2,000 bp maker	TaKaRar	SD0531
50 mL tubes	Nest	602052
50% glutaraldehyde solution	Sangon Biotech	G916054
50x TAE buffer	Sangon Biotech	B548101
6x loading buffer	TaKaRar	SD0503
Agarose	Sangon Biotech	A610013
Anhydrous ethanol	Jkchemical	LB10V37
Biochemistry Cultivation Cabinet	Shanghaiyiheng	LRH-250F
Chloroform	Juhua	61553
Commercial beetle traps	FEIMENGDI	BF-8	www.yinyouji.com
Gel imager	Bio-Rad	GelDoc XR+
Glycerol	Sangon Biotech	A600232
High speed refrigerated centrifuge	Sigma	D-37520
High-Pressure Steam Sterilization Pot	Mettler Toledo	JA5003
Isopropyl alcohol	General-reagent	G75885B
Nucleic acid dye	Sangon Biotech	A616696
Optical Microscope, OM	Leica	DM2000
Parafilm	Parafilm	PM996
PCR meter	Heal Force	Trident960
Penicillin G	Marklin	GB15743
Potato dextrose agar, PDA	Oxoid	CM0139
Potato dextrose broth, PDB	Solarbio	P9240
Primers	Sangon Biotech	/
Primers Taq	TaKaRar	RR902A
Rapid Fungi Genomic DNA Isolation Kit	Sangon Biotech	B518229
Scanning Electron Microscope, SEM	Hitachi	S-3400N
Streptomycin	Marklin	S6153
Tetracycline	Marklin	T829835
Tween-80	Marklin	T6336
Vacuum freeze dryer	Yamato	DC801
Vortex Shaker	HLD	WH-861
β-Mercaptoethanol	Marklin	M6230