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In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Aqui apresentamos um protocolo para obtenção de fungos entomopatogênicos de uma broca florestal e uma forma substitutiva de avaliar suas atividades entomopatogênicas usando um inseto modelo coleóptero. Este método é eficiente e conveniente para explorar recursos fúngicos entomopatogênicos de pragas de insetos perfuradores de madeira em florestas naturais.

Abstract

As brocas florestais causam graves danos às árvores e perdas econômicas em todo o mundo. A liberação de fungos entomopatogênicos (PFE) durante o período de emergência do BEF é considerada uma alternativa aceitável ao controle químico. No entanto, os recursos do EPF têm sido significativamente menos explorados para FWBs, em contraste com as pragas de insetos agrícolas. Este artigo apresenta um protocolo para explorar os recursos do PFE de FWBs usando populações selvagens de Monochamus alternatus como exemplo. Neste protocolo, a atribuição de armadilhas iscadas com M. Alternatus atrativos para diferentes populações garantiram a coleta de amostras adequadas com sintomas naturais de infecção, durante os períodos de emergência do besouro. Após dissecar finamente os tegumentos e colocá-los em um meio seletivo, as espécies de fungos foram isoladas de cada parte dos corpos dos besouros e identificadas com base em características moleculares e morfológicas.

Várias espécies de fungos foram certificadas como EPFs parasitas por meio da reinfecção de M. alternatus saudáveis com suspensões de esporos. Seus fenótipos comportamentais em M. alternatus foram observados usando microscopia eletrônica de varredura e posteriormente comparados com os do inseto modelo coleóptero Tribolium castaneum. Para os EPFs que apresentam fenótipos de parasitismo consistentes em ambas as espécies de besouros, a avaliação de suas atividades sobre T. castaneum forneceu informações valiosas sobre letalidade para estudos futuros sobre M. alternatus. Este protocolo ajudou na descoberta de EPF recém-relatado em populações de M. alternatus na China, que poderia ser aplicado como uma abordagem eficiente para explorar mais recursos de EPF de outros FWBs.

Introduction

A devastação causada por insetos-praga levou a grandes perdas ecológicas e econômicas nos ecossistemas florestais e agrícolas. A maioria das pragas agrícolas se expõe a inimigos naturais ou agentes de controle artificiais enquanto danifica as plantas hospedeiras. Em vez disso, as brocas florestais (FWB) quase completam todos os seus ciclos de desenvolvimento dentro dos troncos das árvores hospedeiras1, o que levanta grandes desafios para explorar organismos eficientes de biocontrole de FWB no campo selvagem. O que é ainda pior é que os BEF carregam um grande número de fitopatógenos2 ou t....

Protocol

1. Isolamento de fungos de M. alternatus (Figura 1)

  1. Colete a amostra de besouro
    1. Colete os besouros serradores de pinheiros M. alternatus usando armadilhas comerciais (ver Tabela de Materiais) iscadas com atrativos antes dos períodos de emergência previstos das populações de besouros em florestas de pinheiros naturalmente infectadas.
      NOTA: Neste estudo, os b.......

Representative Results

Isolamento e identificação de isolados fúngicos de M. alternatus
Com a ajuda de armadilhas atrativas, um grande número (aproximadamente 500 besouros no total) de M. alternatus foram coletados em cinco regiões geográficas. Cadáveres de besouros com sintomas típicos de infecção por fungos entomopatogênicos foram colhidos; Em seguida, os tegumentos corporais de cada besouro foram dissecados em várias posições, conforme d.......

Discussion

Diferentes populações geográficas de BEF podem desenvolver interações variadas com os fungos entomopatogênicos naturais, devido à adaptação ambiental de longo prazo das espécies de PFE aos fatores climáticos locais e à população genotípica específica do inseto hospedeiro44,45. A expansão dos locais de amostragem para múltiplas regiões de ocorrência de insetos ajuda a aumentar a possibilidade de aquisição de .......

Acknowledgements

Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento da China (2021YFC2600100) e pela Fundação de Ciências Naturais da Província de Zhejiang (LY21C040001).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL, 2 mL centrifuge tubesBiosharpBS-15-M
10 µL pipet tipsSangon BiotechF601216
10 µL, 20 µL, 100 µL, 200 µL, 1,000 µL pipettesRainin
1,000 µL pipet tipsSangon BiotechF630102
2 mL cryogenic vialsCorning430659
20x PBS bufferSangon BiotechB548117-0500
200 µL pipet tipsSangon BiotechF601227
2,000 bp makerTaKaRarSD0531
50 mL tubesNest602052
50% glutaraldehyde solutionSangon BiotechG916054
50x TAE bufferSangon BiotechB548101
6x loading bufferTaKaRarSD0503
AgaroseSangon BiotechA610013
Anhydrous ethanolJkchemicalLB10V37
Biochemistry Cultivation CabinetShanghaiyihengLRH-250F
ChloroformJuhua61553
Commercial beetle trapsFEIMENGDIBF-8www.yinyouji.com
Gel imagerBio-RadGelDoc XR+
GlycerolSangon BiotechA600232
High speed refrigerated centrifugeSigmaD-37520
High-Pressure Steam Sterilization PotMettler ToledoJA5003
Isopropyl alcoholGeneral-reagentG75885B
Nucleic acid dyeSangon BiotechA616696
Optical Microscope, OMLeicaDM2000
ParafilmParafilmPM996
PCR meterHeal ForceTrident960
Penicillin GMarklinGB15743
Potato dextrose agar, PDAOxoidCM0139
Potato dextrose broth, PDBSolarbioP9240
PrimersSangon Biotech/
Primers TaqTaKaRarRR902A
Rapid Fungi Genomic DNA Isolation KitSangon BiotechB518229
Scanning Electron Microscope, SEMHitachiS-3400N
StreptomycinMarklinS6153
TetracyclineMarklinT829835
Tween-80MarklinT6336
Vacuum freeze dryerYamatoDC801
Vortex ShakerHLDWH-861
β-MercaptoethanolMarklinM6230

References

  1. Hajek, A. E., Bauer, L. S. Microbial control of wood-boring insects attacking forest and shade trees. Field Manual of Techniques in Invertebrate Pathology. 10, 505-525 (2007).
  2. Linnakoski, R., Forbes, K. M.

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