Isolamento, Identificação Comportamental e Avaliação de Patogenicidade de Fungos Entomopatogênicos de uma Broca da Madeira Florestal

Summary

Aqui apresentamos um protocolo para obtenção de fungos entomopatogênicos de uma broca florestal e uma forma substitutiva de avaliar suas atividades entomopatogênicas usando um inseto modelo coleóptero. Este método é eficiente e conveniente para explorar recursos fúngicos entomopatogênicos de pragas de insetos perfuradores de madeira em florestas naturais.

Abstract

As brocas florestais causam graves danos às árvores e perdas econômicas em todo o mundo. A liberação de fungos entomopatogênicos (PFE) durante o período de emergência do BEF é considerada uma alternativa aceitável ao controle químico. No entanto, os recursos do EPF têm sido significativamente menos explorados para FWBs, em contraste com as pragas de insetos agrícolas. Este artigo apresenta um protocolo para explorar os recursos do PFE de FWBs usando populações selvagens de Monochamus alternatus como exemplo. Neste protocolo, a atribuição de armadilhas iscadas com M. Alternatus atrativos para diferentes populações garantiram a coleta de amostras adequadas com sintomas naturais de infecção, durante os períodos de emergência do besouro. Após dissecar finamente os tegumentos e colocá-los em um meio seletivo, as espécies de fungos foram isoladas de cada parte dos corpos dos besouros e identificadas com base em características moleculares e morfológicas.

Várias espécies de fungos foram certificadas como EPFs parasitas por meio da reinfecção de M. alternatus saudáveis com suspensões de esporos. Seus fenótipos comportamentais em M. alternatus foram observados usando microscopia eletrônica de varredura e posteriormente comparados com os do inseto modelo coleóptero Tribolium castaneum. Para os EPFs que apresentam fenótipos de parasitismo consistentes em ambas as espécies de besouros, a avaliação de suas atividades sobre T. castaneum forneceu informações valiosas sobre letalidade para estudos futuros sobre M. alternatus. Este protocolo ajudou na descoberta de EPF recém-relatado em populações de M. alternatus na China, que poderia ser aplicado como uma abordagem eficiente para explorar mais recursos de EPF de outros FWBs.

Introduction

A devastação causada por insetos-praga levou a grandes perdas ecológicas e econômicas nos ecossistemas florestais e agrícolas. A maioria das pragas agrícolas se expõe a inimigos naturais ou agentes de controle artificiais enquanto danifica as plantas hospedeiras. Em vez disso, as brocas florestais (FWB) quase completam todos os seus ciclos de desenvolvimento dentro dos troncos das árvores hospedeiras¹, o que levanta grandes desafios para explorar organismos eficientes de biocontrole de FWB no campo selvagem. O que é ainda pior é que os BEF carregam um grande número de fitopatógenos² ou t....

Protocol

1. Isolamento de fungos de M. alternatus (Figura 1)

1. Colete a amostra de besouro
   1. Colete os besouros serradores de pinheiros M. alternatus usando armadilhas comerciais (ver Tabela de Materiais) iscadas com atrativos antes dos períodos de emergência previstos das populações de besouros em florestas de pinheiros naturalmente infectadas.
      NOTA: Neste estudo, os b.......

Discussion

Diferentes populações geográficas de BEF podem desenvolver interações variadas com os fungos entomopatogênicos naturais, devido à adaptação ambiental de longo prazo das espécies de PFE aos fatores climáticos locais e à população genotípica específica do inseto hospedeiro^44,45. A expansão dos locais de amostragem para múltiplas regiões de ocorrência de insetos ajuda a aumentar a possibilidade de aquisição de .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL, 2 mL centrifuge tubes	Biosharp	BS-15-M
10 µL pipet tips	Sangon Biotech	F601216
10 µL, 20 µL, 100 µL, 200 µL, 1,000 µL pipettes	Rainin
1,000 µL pipet tips	Sangon Biotech	F630102
2 mL cryogenic vials	Corning	430659
20x PBS buffer	Sangon Biotech	B548117-0500
200 µL pipet tips	Sangon Biotech	F601227
2,000 bp maker	TaKaRar	SD0531
50 mL tubes	Nest	602052
50% glutaraldehyde solution	Sangon Biotech	G916054
50x TAE buffer	Sangon Biotech	B548101
6x loading buffer	TaKaRar	SD0503
Agarose	Sangon Biotech	A610013
Anhydrous ethanol	Jkchemical	LB10V37
Biochemistry Cultivation Cabinet	Shanghaiyiheng	LRH-250F
Chloroform	Juhua	61553
Commercial beetle traps	FEIMENGDI	BF-8	www.yinyouji.com
Gel imager	Bio-Rad	GelDoc XR+
Glycerol	Sangon Biotech	A600232
High speed refrigerated centrifuge	Sigma	D-37520
High-Pressure Steam Sterilization Pot	Mettler Toledo	JA5003
Isopropyl alcohol	General-reagent	G75885B
Nucleic acid dye	Sangon Biotech	A616696
Optical Microscope, OM	Leica	DM2000
Parafilm	Parafilm	PM996
PCR meter	Heal Force	Trident960
Penicillin G	Marklin	GB15743
Potato dextrose agar, PDA	Oxoid	CM0139
Potato dextrose broth, PDB	Solarbio	P9240
Primers	Sangon Biotech	/
Primers Taq	TaKaRar	RR902A
Rapid Fungi Genomic DNA Isolation Kit	Sangon Biotech	B518229
Scanning Electron Microscope, SEM	Hitachi	S-3400N
Streptomycin	Marklin	S6153
Tetracycline	Marklin	T829835
Tween-80	Marklin	T6336
Vacuum freeze dryer	Yamato	DC801
Vortex Shaker	HLD	WH-861
β-Mercaptoethanol	Marklin	M6230