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Aqui apresentamos um protocolo para obtenção de fungos entomopatogênicos de uma broca florestal e uma forma substitutiva de avaliar suas atividades entomopatogênicas usando um inseto modelo coleóptero. Este método é eficiente e conveniente para explorar recursos fúngicos entomopatogênicos de pragas de insetos perfuradores de madeira em florestas naturais.
As brocas florestais causam graves danos às árvores e perdas econômicas em todo o mundo. A liberação de fungos entomopatogênicos (PFE) durante o período de emergência do BEF é considerada uma alternativa aceitável ao controle químico. No entanto, os recursos do EPF têm sido significativamente menos explorados para FWBs, em contraste com as pragas de insetos agrícolas. Este artigo apresenta um protocolo para explorar os recursos do PFE de FWBs usando populações selvagens de Monochamus alternatus como exemplo. Neste protocolo, a atribuição de armadilhas iscadas com M. Alternatus atrativos para diferentes populações garantiram a coleta de amostras adequadas com sintomas naturais de infecção, durante os períodos de emergência do besouro. Após dissecar finamente os tegumentos e colocá-los em um meio seletivo, as espécies de fungos foram isoladas de cada parte dos corpos dos besouros e identificadas com base em características moleculares e morfológicas.
Várias espécies de fungos foram certificadas como EPFs parasitas por meio da reinfecção de M. alternatus saudáveis com suspensões de esporos. Seus fenótipos comportamentais em M. alternatus foram observados usando microscopia eletrônica de varredura e posteriormente comparados com os do inseto modelo coleóptero Tribolium castaneum. Para os EPFs que apresentam fenótipos de parasitismo consistentes em ambas as espécies de besouros, a avaliação de suas atividades sobre T. castaneum forneceu informações valiosas sobre letalidade para estudos futuros sobre M. alternatus. Este protocolo ajudou na descoberta de EPF recém-relatado em populações de M. alternatus na China, que poderia ser aplicado como uma abordagem eficiente para explorar mais recursos de EPF de outros FWBs.
A devastação causada por insetos-praga levou a grandes perdas ecológicas e econômicas nos ecossistemas florestais e agrícolas. A maioria das pragas agrícolas se expõe a inimigos naturais ou agentes de controle artificiais enquanto danifica as plantas hospedeiras. Em vez disso, as brocas florestais (FWB) quase completam todos os seus ciclos de desenvolvimento dentro dos troncos das árvores hospedeiras1, o que levanta grandes desafios para explorar organismos eficientes de biocontrole de FWB no campo selvagem. O que é ainda pior é que os BEF carregam um grande número de fitopatógenos2 ou t....
1. Isolamento de fungos de M. alternatus (Figura 1)
Isolamento e identificação de isolados fúngicos de M. alternatus
Com a ajuda de armadilhas atrativas, um grande número (aproximadamente 500 besouros no total) de M. alternatus foram coletados em cinco regiões geográficas. Cadáveres de besouros com sintomas típicos de infecção por fungos entomopatogênicos foram colhidos; Em seguida, os tegumentos corporais de cada besouro foram dissecados em várias posições, conforme d.......
Diferentes populações geográficas de BEF podem desenvolver interações variadas com os fungos entomopatogênicos naturais, devido à adaptação ambiental de longo prazo das espécies de PFE aos fatores climáticos locais e à população genotípica específica do inseto hospedeiro44,45. A expansão dos locais de amostragem para múltiplas regiões de ocorrência de insetos ajuda a aumentar a possibilidade de aquisição de .......
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento da China (2021YFC2600100) e pela Fundação de Ciências Naturais da Província de Zhejiang (LY21C040001).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.5 mL, 2 mL centrifuge tubes | Biosharp | BS-15-M | |
10 µL pipet tips | Sangon Biotech | F601216 | |
10 µL, 20 µL, 100 µL, 200 µL, 1,000 µL pipettes | Rainin | ||
1,000 µL pipet tips | Sangon Biotech | F630102 | |
2 mL cryogenic vials | Corning | 430659 | |
20x PBS buffer | Sangon Biotech | B548117-0500 | |
200 µL pipet tips | Sangon Biotech | F601227 | |
2,000 bp maker | TaKaRar | SD0531 | |
50 mL tubes | Nest | 602052 | |
50% glutaraldehyde solution | Sangon Biotech | G916054 | |
50x TAE buffer | Sangon Biotech | B548101 | |
6x loading buffer | TaKaRar | SD0503 | |
Agarose | Sangon Biotech | A610013 | |
Anhydrous ethanol | Jkchemical | LB10V37 | |
Biochemistry Cultivation Cabinet | Shanghaiyiheng | LRH-250F | |
Chloroform | Juhua | 61553 | |
Commercial beetle traps | FEIMENGDI | BF-8 | www.yinyouji.com |
Gel imager | Bio-Rad | GelDoc XR+ | |
Glycerol | Sangon Biotech | A600232 | |
High speed refrigerated centrifuge | Sigma | D-37520 | |
High-Pressure Steam Sterilization Pot | Mettler Toledo | JA5003 | |
Isopropyl alcohol | General-reagent | G75885B | |
Nucleic acid dye | Sangon Biotech | A616696 | |
Optical Microscope, OM | Leica | DM2000 | |
Parafilm | Parafilm | PM996 | |
PCR meter | Heal Force | Trident960 | |
Penicillin G | Marklin | GB15743 | |
Potato dextrose agar, PDA | Oxoid | CM0139 | |
Potato dextrose broth, PDB | Solarbio | P9240 | |
Primers | Sangon Biotech | / | |
Primers Taq | TaKaRar | RR902A | |
Rapid Fungi Genomic DNA Isolation Kit | Sangon Biotech | B518229 | |
Scanning Electron Microscope, SEM | Hitachi | S-3400N | |
Streptomycin | Marklin | S6153 | |
Tetracycline | Marklin | T829835 | |
Tween-80 | Marklin | T6336 | |
Vacuum freeze dryer | Yamato | DC801 | |
Vortex Shaker | HLD | WH-861 | |
β-Mercaptoethanol | Marklin | M6230 |
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