Desenvolvimento e Otimização de um Modelo Organoide Derivado de Pacientes com Carcinoma Hepatocelular Humano para Identificação de Alvos Potenciais e Descoberta de Drogas

Summary

Fornecemos uma visão abrangente e refinamento dos protocolos existentes para a formação de organoides de carcinoma hepatocelular (CHC), abrangendo todas as etapas do cultivo de organoides. Esse sistema serve como um modelo valioso para a identificação de potenciais alvos terapêuticos e a avaliação da efetividade de candidatos a fármacos.

Abstract

O carcinoma hepatocelular (CHC) é um tumor altamente prevalente e letal em todo o mundo e sua descoberta tardia e a falta de agentes terapêuticos específicos eficazes requerem mais pesquisas sobre sua patogênese e tratamento. Os organoides, um novo modelo que se assemelha muito ao tecido tumoral nativo e pode ser cultivado in vitro, têm despertado interesse significativo nos últimos anos, com numerosos relatos sobre o desenvolvimento de modelos organoides para câncer de fígado. Neste estudo, otimizamos com sucesso o procedimento e estabelecemos um protocolo de cultura que permite a formação de organoides de CHC de maior tamanho com condições estáveis de passagem e cultura. Descrevemos de forma abrangente cada etapa do procedimento, cobrindo todo o processo de dissociação tecidual do CHC, plaqueamento organoide, cultura, passagem, criopreservação e ressuscitação, e fornecemos precauções detalhadas neste artigo. Esses organoides exibem similaridade genética com os tecidos originais do CHC e podem ser utilizados para diversas aplicações, incluindo a identificação de potenciais alvos terapêuticos para tumores e subsequente desenvolvimento de drogas.

Introduction

O carcinoma hepatocelular (CHC), um tumor prevalente e extensamente^diverso1, tem recebido considerável atenção na comunidade médica. A presença de plasticidade de linhagem e heterogeneidade substancial no CHC sugere que células tumorais originadas de vários pacientes e mesmo lesões distintas dentro de um mesmo paciente podem manifestar características moleculares e fenotípicas diferentes, apresentando obstáculos formidáveis no avanço de abordagens terapêuticas inovadoras2,3,4,5. Consequentemente, é imperiosa a necessi....

Protocol

Tecidos biopsiados por humanos foram obtidos do respectivo paciente no Hospital e Instituto de Câncer Afiliado da Universidade de Medicina de Guangzhou, e consentimento informado foi obtido dos pacientes. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todos os materiais, reagentes e instrumentos usados neste protocolo.

1. Estabelecimento de organoides de CHC derivados do paciente a partir de amostras cirúrgicas

NOTA: O est.......

Discussion

Um benefício notável dos modelos organoides derivados do paciente reside em sua capacidade de replicar fielmente as características biológicas dos tumores, abrangendo a estrutura do tecido e a paisagem genômica. Esses modelos demonstram um notável nível de acurácia e refletem efetivamente a heterogeneidade e a progressão dos tumores, mesmo durante longos períodos de^cultivo6,8,9. Através da utilização deste refinado .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
[Leu15]-gastrin I human	Merck	G9145
1.5 mL Microtubes	Merck	AXYMCT150LC
A8301 (TGFβ inhibitor)	Tocris Bioscience	2939
B27 Supplement (503), minus vitamin A	Thermo Fisher Scientific	12587010
B-27 Supplement (503), serum-free	Thermo Fisher Scientific	17504044
BMP7	Peprotech	120-03P
Cell strainer size 100 μm	Merck	CLS352360
CHIR99021	Merck	SML1046
Collagenase D	Merck	11088858001
Corning Costar Ultra-Low	Merck	CLS3473
Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile	Corning	3473
Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile	Corning	3471
Cultrex Organoid Harvesting Solution	R&D SYSTEMS	3700-100-01	Organoid harvesting solution
Cultrex Reduced Growth Factor BME, Type 2 PathClear (BME)	Merck	3533-005-02
DAPT	Merck	D5942
Dexamethasone	Merck	D4902
DMSO	Merck	C6164
DNaseI	Merck	DN25
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12	Thermo Fisher Scientific	12634028	Advanced DMEM/F-12
Earle’s balanced salt solution (EBSS)	Thermo Fisher Scientific	24010043
Forceps	N/A	N/A
Forskolin	Tocris Bioscience	1099
GlutaMAX supplement	Thermo Fisher Scientific	35050061
HEPES, 1 M	Thermo Fisher Scientific	15630080
Leica DM6 B Fluorescence Motorized Microscope	Leica	N/A
N2 supplement (1003)	Thermo Fisher Scientific	17502048
N-acetylcysteine	Merck	A0737-5MG
Nicotinamide	Merck	N0636
Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339651
Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339653
Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
Recombinant human EGF	Peprotech	AF-100-15
Recombinant human FGF10	Peprotech	100-26
Recombinant human FGF19	Peprotech	100-32
Recombinant human HGF	Peprotech	100-39
Recombinant human Noggin	Peprotech	120-10C
Rho kinase inhibitor Y-27632 dihydrochloride	Merck	Y0503
R-spodin1-conditioned medium	(Broutier et al.)	N/A	Secretion of cell lines
Surgical scissors	N/A	N/A
Surgical specimen of tumor removed from HCC patients	Affiliated Cancer Hospital and Institute of Guangzhou Medical University	N/A
TNFα	Peprotech	315-01A
TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red	Thermo Fisher Scientific	12604013	Trypsin substitute
Wnt-3a-conditioned medium	(Broutier et al.)	N/A	Secretion of cell lines