Разработка и оптимизация модели органоида гепатоцеллюлярной карциномы человека, полученной от пациента, для идентификации потенциальных мишеней и поиска лекарств

Summary

Мы предоставляем всесторонний обзор и уточнение существующих протоколов формирования органоидов гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК), охватывающих все этапы культивирования органоидов. Эта система служит ценной моделью для идентификации потенциальных терапевтических мишеней и оценки эффективности препаратов-кандидатов.

Abstract

Гепатоцеллюлярная карцинома (ГЦК) является широко распространенной и смертельной опухолью во всем мире, и ее позднее обнаружение и отсутствие эффективных специфических терапевтических агентов требуют дальнейших исследований ее патогенеза и лечения. Органоиды, новая модель, которая очень похожа на нативную опухолевую ткань и может быть культивирована in vitro, вызвали значительный интерес в последние годы, с многочисленными сообщениями о разработке органоидных моделей для рака печени. В этом исследовании мы успешно оптимизировали процедуру и разработали протокол культивирования, который позволяет формировать органоиды ГЦК более крупного размера со стабильными условиями пассажа и культивирования. В этой статье мы подробно описали каждый этап процедуры, охватывая весь процесс диссоциации тканей ГЦК, органоидного покрытия, культивирования, пассажа, криоконсервации и реанимации, а также подробно описали меры предосторожности. Эти органоиды демонстрируют генетическое сходство с исходными тканями ГЦК и могут быть использованы для различных применений, включая идентификацию потенциальных терапевтических мишеней для опухолей и последующую разработку лекарств.

Introduction

Гепатоцеллюлярная карцинома (ГЦК), широко распространенная и широко разнообразная опухоль¹, привлекла значительное внимание в медицинском сообществе. Наличие линейной пластичности и существенной гетерогенности в ГЦК позволяет предположить, что опухолевые клетки, происходящие от разных пациентов, и даже различные поражения у одного и того же пациента могут проявлять несхожие молекулярные и фенотипические признаки, тем самым создавая огромные препятствия для продвижения инновационных терапевтических подходов 2,3,4,5 . ....

Protocol

Биопсия тканей человека была получена от соответствующего пациента в Аффилированной онкологической больнице и Институте Медицинского университета Гуанчжоу, и от пациентов было получено информированное согласие. Подробные сведения обо всех материалах, реагентах и инструментах, испо.......

Discussion

Одним из заметных преимуществ органоидных моделей, полученных от пациентов, является их способность точно воспроизводить биологические характеристики опухолей, охватывая структуру тканей и геномный ландшафт. Эти модели демонстрируют выдающийся уровень точности и эффективно отража?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
[Leu15]-gastrin I human	Merck	G9145
1.5 mL Microtubes	Merck	AXYMCT150LC
A8301 (TGFβ inhibitor)	Tocris Bioscience	2939
B27 Supplement (503), minus vitamin A	Thermo Fisher Scientific	12587010
B-27 Supplement (503), serum-free	Thermo Fisher Scientific	17504044
BMP7	Peprotech	120-03P
Cell strainer size 100 μm	Merck	CLS352360
CHIR99021	Merck	SML1046
Collagenase D	Merck	11088858001
Corning Costar Ultra-Low	Merck	CLS3473
Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile	Corning	3473
Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile	Corning	3471
Cultrex Organoid Harvesting Solution	R&D SYSTEMS	3700-100-01	Organoid harvesting solution
Cultrex Reduced Growth Factor BME, Type 2 PathClear (BME)	Merck	3533-005-02
DAPT	Merck	D5942
Dexamethasone	Merck	D4902
DMSO	Merck	C6164
DNaseI	Merck	DN25
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12	Thermo Fisher Scientific	12634028	Advanced DMEM/F-12
Earle’s balanced salt solution (EBSS)	Thermo Fisher Scientific	24010043
Forceps	N/A	N/A
Forskolin	Tocris Bioscience	1099
GlutaMAX supplement	Thermo Fisher Scientific	35050061
HEPES, 1 M	Thermo Fisher Scientific	15630080
Leica DM6 B Fluorescence Motorized Microscope	Leica	N/A
N2 supplement (1003)	Thermo Fisher Scientific	17502048
N-acetylcysteine	Merck	A0737-5MG
Nicotinamide	Merck	N0636
Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339651
Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339653
Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
Recombinant human EGF	Peprotech	AF-100-15
Recombinant human FGF10	Peprotech	100-26
Recombinant human FGF19	Peprotech	100-32
Recombinant human HGF	Peprotech	100-39
Recombinant human Noggin	Peprotech	120-10C
Rho kinase inhibitor Y-27632 dihydrochloride	Merck	Y0503
R-spodin1-conditioned medium	(Broutier et al.)	N/A	Secretion of cell lines
Surgical scissors	N/A	N/A
Surgical specimen of tumor removed from HCC patients	Affiliated Cancer Hospital and Institute of Guangzhou Medical University	N/A
TNFα	Peprotech	315-01A
TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red	Thermo Fisher Scientific	12604013	Trypsin substitute
Wnt-3a-conditioned medium	(Broutier et al.)	N/A	Secretion of cell lines