ציטומטריית זרימה של הדמיה לחקר צבירה עצמית מיקרוביאלית

Summary

פרוטוקול זה מתאר גישה כמותית למדידת צבירה עצמית מיקרוביאלית באמצעות ציטומטריית זרימת הדמיה.

Abstract

חיידקים מועילים ופרוביוטיים ממלאים תפקידים חיוניים בפונדקאים שלהם, ומספקים יתרונות בריאותיים שונים, כולל חסינות למחלות זיהומיות. משפחת Lactobacillaceae מורכבת מחיידקים גראם-חיוביים עם תכונות פרוביוטיות מוכחות. מחקר זה משתמש בזני Lactobacillaceae כמודל להדגמת היעילות של ניתוח תפוקה גבוהה של תא בודד בחקר צבירה תאית. ההתמקדות היא בניתוח התגובה של מינים מועילים אלה לפחמימות פשוטות מהתזונה.

המחקר מראה כיצד ציטומטריית זרימת הדמיה (IFC) יכולה להתגבר על ההבדלים הבסיסיים בהרכבה של חיידקים פרוביוטיים בנוכחות והיעדר פחמימות. IFC משלב את העוצמה והמהירות של ציטומטריית זרימה קונבנציונלית עם הרזולוציה המרחבית של מיקרוסקופיה, ומאפשר מדידות מורפומטריות מורכבות בקצב גבוה באופן מוגדר פנוטיפית על פני ספרייה של זנים ותנאים מועילים של חיידקים. פרוטוקול זה מספק תובנות לגבי הצבירה העצמית של מיני Lactobacillaceae ושופך אור על התגובה שלהם לפחמימות תזונתיות, מה שתורם להבנת המנגנונים מאחורי ההשפעות המועילות של חיידקים פרוביוטיים אלה.

Introduction

צבירה עצמית של חיידקים נחשבת לשלב ראשוני בהיווצרות ביופילם. בתהליך זה (המכונה לעתים גם autoagglutination או flocculation), חיידקים מאותו סוג יוצרים גושים רב-תאיים שבסופו של דבר מתיישבים בתחתית צינורות התרבית או נצמדים לרקמת המטרה או לפני השטח שלהם¹.

אוטואגרגציה היא תופעה נפוצה והוכחה עד כה בפתוגנים גראם-שליליים כגון הפתוגן האופורטוניסטי Acinetobacter baumannii², הפתוגן הדנטלי Aggregobacter actinomycetemcomitans³, והפתוגן המתהווה Burkholderia pseudomallei⁴. צבירה עצמית תוארה גם במספר זנים פרוביוטיים גראם-חיוביים

Protocol

קובץ ה- .ast, עם התבנית עבור Lacticaseibacillus rhamnosus GG (LGG) כדוגמה, מסופק בקובץ קידוד משלים 1.

1. הכנת מדיה

1. הכינו ציר Lactobacilli MRS בהתאם להוראות היצרן (55 גרם ב-1 ליטר מים נטולי יונים) וצלחות אגר Lactobacilli MRS עם אגר 1.5% (w/v) אגר (ראו טבלת חומרים). לאחר עיקור autoclave, המ?.......

Discussion

ציטומטריית זרימה היא שיטה נפוצה לכימות עוצמות פלואורסצנטיות בתאים איקריוטים, אך היא עשויה שלא לספק מדידות מדויקות עבור תאי חיידקים בשל גודלם הגדול יותר או אגרגטים קטנים. גורמים אלה יכולים להשפיע באופן משמעותי על הכימות המדויק של אוטואגרגציה ועל הרמה הבסיסית של היווצרות אגרגטים בתנאים ש?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
14 mL culture tubes	Falcon	352051
15 mL centrifuge tube	Falcon	352096
Bacto Agar	Baeton,Dickinson and Company	214010
Bacto Typtic Soy Broth	Baeton,Dickinson and Company	211825
D-(+)-Glucose	Sigma	G7021-1KG
D-(+)-Raffinose pentahydrate	Sigma	83400-25G
Difco Lactobacilli MRS broth	Baeton,Dickinson and Company	288130
EASY-LOCK MICROPR. 1.5 mL (Eppendorf)	FL medical	23053
IDEAS Software	Amnis/EMD Millipore	N/A	Details available at: https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150212_144049?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F&bd=1
ImageStream X Mark II	Amnis/EMD Millipore	N/A	Details available at: https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150121_205948?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
MOPS, 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid	Fisher bioreagents	BP308-500
Potassium phosphate dibasic	Fisher Scientific, 174.18 g/mol	BP363-1
Potassium phosphate monobasic	Sigma, 136.09 g/mol	P0662-500G