Abordagens Complementares para Interrogar o Fluxo de Mitofagia em Células β Pancreáticas

Summary

Este protocolo descreve dois métodos para a análise quantitativa da mitofagia em células β pancreáticas: primeiro, uma combinação de corantes específicos para mitocôndrias permeáveis a células e, segundo, um repórter de mitofagia codificado geneticamente. Essas duas técnicas são complementares e podem ser empregadas com base em necessidades específicas, permitindo flexibilidade e precisão na abordagem quantitativa do controle de qualidade mitocondrial.

Abstract

A mitofagia é um mecanismo de controle de qualidade necessário para manter a função mitocondrial ideal. A mitofagia disfuncional de células β resulta em liberação insuficiente de insulina. Avaliações quantitativas avançadas de mitofagia geralmente requerem o uso de repórteres genéticos. O modelo de camundongo mt-Keima, que expressa uma sonda de dupla excitação sensível ao pH para quantificar a mitofagia via citometria de fluxo, foi otimizado em células β. A razão entre as emissões de comprimento de onda mt-Keima ácido-neutro pode ser usada para quantificar robustamente a mitofagia. No entanto, o uso de mitofagia genética pode ser um desafio ao trabalhar com modelos genéticos complexos de camundongos ou células difíceis de transfectar, como ilhotas humanas primárias. Este protocolo descreve um novo método complementar baseado em corantes para quantificar a mitofagia de células β em ilhotas primárias usando MtPhagy. A MtPhagy é um corante celular sensível ao pH que se acumula nas mitocôndrias e aumenta sua intensidade de fluorescência quando as mitocôndrias estão em ambientes de pH baixo, como os lisossomos durante a mitofagia. Combinando o corante MtPhagy com Fluozin-3-AM, um indicador de Zn²⁺ que seleciona para células β, e Tetrametilrodamina, éster etílico (TMRE) para avaliar o potencial de membrana mitocondrial, o fluxo de mitofagia pode ser quantificado especificamente em células β via citometria de fluxo. Essas duas abordagens são altamente complementares, permitindo flexibilidade e precisão na avaliação do controle de qualidade mitocondrial em inúmeros modelos de células β.

Introduction

As células β pancreáticas produzem e secretam insulina para atender às demandas metabólicas, e a disfunção das células β é responsável pela hiperglicemia e pelo aparecimento de diabetes tanto no diabetes tipo 1 quanto no tipo 2. As células β acoplam o metabolismo da glicose à secreção de insulina via produção energética e metabólica mitocondrial, que dependem de uma reserva de massa mitocondrial funcional ^1,2,3. Para manter a função ótima das células β, as células β dependem de mecanismos de controle de qualidade mitocondrial para remover mitocôndrias envelhecidas ou danifica....

Protocol

Os estudos em animais apresentados neste protocolo foram revisados e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Michigan. Camundongos C57BL/6J machos de vinte semanas de idade, com dieta regular de gordura (RFD) ou dieta hiperlipídica (HFD), foram usados para este estudo.

1. Avaliação da mitofagia através da abordagem MtPhagy baseada em corantes (Método 1)

1. Preparação e tratamento de ilhotas de camundongos
   1. Realiz.......

Discussion

Este protocolo descreveu dois métodos complementares para quantificar o fluxo de mitofagia em ilhotas primárias dissociadas de camundongos. Usando o método mt-Keima, um aumento na mitofagia foi quantificado como um aumento da razão de células ácidas (561 nm)/neutras (405 nm), enquanto no método MtPhagy, o aumento do fluxo de mitofagia foi quantificado como um aumento na população de células baixas de MtPhagy^altaMtPhagy Fluozin^alta. Esses métodos permitem avaliações rápidas,.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibiotic-Antimycotic	Life Technologies	15240-062
Attune NxT Flow Cytometer	Thermofisher Scientific	A24858
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Thermofisher Scientific	D1306	DAPI reconstituted in ddH2O to reach 0.2 µg/mL stock
Dimethyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	317275
Fatty Acid Free heat shock BSA powder	Equitech	BAH66
Fetal bovine serum	Gemini Bio	900-108
Fluozin-3AM	Thermofisher Scientific	F24195	100 μg Fluozin-3AM powder reconstituted in 51 μL DMSO and 51 μL Pluronic F-127 to reach 1 mM stock.
Gibco RPMI 1640 Medium	Fisher Scientific	11-875-093
HEPES (1M)	Life Technologies	15630-080
MtPhagy dye	Dojindo	MT02-10	5 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock.
MtPhagy dye	Dojindo	MT02-10
Penicillin-Streptomycin (100x)	Life Technologies	15140-122	1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O
Phosphate buffered saline, 10x	Fisher Scientific	BP399-20	1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O
Sodium Pyruvate (100x)	Life Technologies	11360-070	5 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock.
TMRE [Tetramethylrhodamine, ethyl ester, perchlorate]	Anaspec	AS-88061	TMRE powder reconstituted in DMSO to reach 100 μM stock.
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Thermofisher Scientific	25300054
Valinomycin	Sigma	V0627	Valinomycin powder reconsituted in DMSO to reach 250 nM stock.