Analisi multiomica del TMEM200A come biomarcatore pan-tumorale

Summary

Qui viene presentato un protocollo in cui vengono combinati più strumenti bioinformatici per studiare le funzioni biologiche dei TMEM200A nel cancro. Inoltre, validiamo sperimentalmente le previsioni bioinformatiche.

Abstract

La proteina transmembrana, TMEM200A, è nota per essere associata ai tumori umani e all'infiltrazione immunitaria. Qui, abbiamo valutato la funzione di TMEM200A nei tumori comuni mediante analisi multiomica e abbiamo utilizzato colture cellulari in vitro di cellule gastriche per verificare i risultati. L'espressione di TMEM200A in diversi tipi di cancro umano è stata valutata utilizzando i dati RNA-seq del database Xena dell'UCSC. L'analisi bioinformatica ha rivelato un potenziale ruolo della TMEM200A come biomarcatore diagnostico e prognostico.

Sono state coltivate colture di normali linee cellulari gastriche e tumorali e TMEM200A è stato abbattuto. I livelli di espressione di TMEM200A sono stati misurati utilizzando la reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale e il western blotting. Sono stati quindi utilizzati studi in vitro sulla perdita di funzione per determinare il ruolo delle TMEM200A nel comportamento maligno e nella formazione tumorale delle cellule tumorali gastriche (GC). I Western blot sono stati utilizzati per valutare l'effetto del knockdown sulla transizione epiteliale-mesenchimale (EMT) e sulla via di segnalazione PI3K/AKT nella GC. L'analisi bioinformatica ha mostrato che TMEM200A era espresso ad alti livelli nella GC.

La proliferazione delle cellule GC è stata inibita dal knockdown TMEM200A, che ha anche diminuito la vimentina, la N-caderina e le proteine Snai e ha inibito la fosforilazione di AKT. La via di segnalazione PI3K/AKT sembra anche essere coinvolta nella regolazione mediata da TMEM200A dello sviluppo dei GC. I risultati qui presentati suggeriscono che TMEM200A regola il microambiente tumorale influenzando l'EMT. TMEM200A può anche influenzare l'EMT attraverso la segnalazione PI3K/AKT, influenzando così il microambiente tumorale. Pertanto, nei pan-tumori, in particolare nei GC, TMEM200A può essere un potenziale biomarcatore e oncogene.

Introduction

Il cancro è emerso come un problema persistente di salute pubblica che mette in pericolo la salute umana a livello globale¹a causa dei suoi elevati tassi di morbilità e mortalità in tutto il mondo, ponendo un pesante onere finanziario e medico alla società². Negli ultimi anni sono stati compiuti progressi significativi nella terapia del cancro grazie alla scoperta dei marcatori tumorali³ e i ricercatori hanno sviluppato nuovi metodi diagnostici e nuovi farmaci per il trattamento del cancro. Tuttavia, alcuni pazienti con cancro hanno ancora prognosi sfavorevoli a causa di fattori come la resistenza....

Protocol

1. Il database dell'Atlante del Genoma del Cancro (TCGA)

NOTA: Il database Cancer Genome Atlas (TCGA) contiene i dati di sequenziamento dei geni in diversi tessuti tumorali¹⁴. I dati RNA-seq in TCGA per lo studio dei formati di trascritti TMEM200A per parte per milione (TPM) sono stati estratti dal sito web UCSC Xena ¹⁵ (https://xenabrowser. net/datapages/) e log2 trasformato per confronta.......

Discussion

TMEM200A appartiene a una famiglia di TMEM che è essenziale per la proliferazione delle cellule tumorali³⁸. L'espressione variabile di TMEM200A in diverse neoplasie maligne ha ricevuto meno attenzione e manca un'indagine approfondita sul pan-cancro. Tuttavia, le prove continuano ad accumularsi, dimostrando che la famiglia di proteine transmembrana TMEM può essere importante nel mantenere le cellule tumorali maligne attraverso interazioni con diverse proteine, ad esempio, l'atti.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-AKT antibody	Proteintech Group, Inc	60203-2-Ig
Anti-E-cadherin antibody	Proteintech Group, Inc	20874-1-AP
anti-glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) antibody	Proteintech Group, Inc	10494-1-AP
Anti-N-cadherin antibody	Proteintech Group, Inc	22018-1-AP
Anti-P-AKT antibody	Proteintech Group, Inc	66444-1-Ig
Anti-snail antibody	Proteintech Group, Inc	13099-1-AP
Anti-Vimentin antibody	Proteintech Group, Inc	10366-1-AP
AxyPrepMultisourceTotalRNAMini- prep Kit	Suzhou Youyi Landi Biotechnology Co., Ltd	UEL-UE-MN-MS-RNA-50G
BCA Protein Assay Kit	Epizyme Biotech	ZJ101L
CCK-8 reagent	MedChemExpress	HY-K0301-500T
Fetal bovine serum (FBS)	CYAGEN BIOSCIENCES (GUANGZHOU) INC	FBSSR-01021
GAPDH primer	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.		Forward primer (5’-3’): TGACATCAAGAAGGTG GTGAAGCAG; Reverse primer (5’-3’): GTGTCGCTGTTGAAG TCAGAGGAG
HighGene plus Transfection reagent	ABclonal	RM09014P
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse lgG (H+L)	Proteintech Group, Inc	SA00001-1
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit lgG (H+L)	Proteintech Group, Inc	SA00001-2
Human gastric mucosal epithelial GES-1 cells	Guangzhou Cellcook Biotech Co.,Ltd.
Human STAD HGC-27 cells	Procell Life Science&Technology Co.,Ltd
Human STAD SGC-7901 cells	Procell Life Science&Technology Co.,Ltd
MonAmp SYBR Green qPCR Mix (None ROX)	Mona (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd	MQ10101S
MonScript RTIII All-in-One Mix with dsDNase	Mona (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd	MR05101M
Omni-ECL Femto Light Chemiluminescence Kit	Epizyme Biotech	SQ201
PAGE Gel Fast Preparationb Kit	Epizyme Biotech	PG111
Penicillin-streptomycin (Pen-Strep)	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd	P1400-100
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane	Merck KGaA	IPVH00010-1
Protein Free Rapid Blocking Buffer	Epizyme Biotech	PS108P
RIPA lysis solution	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd	R0010
RPMI 1640 complete medium	Thermo Fisher Scientific	C11875500BT
Skimmed milk	Campina: Elk
TBST buffer solution	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd	T1082
The protein loading buffer	Epizyme Biotech	LT101S
TMEM200A knockdown plasmid	MiaoLing Plasmid
TMEM200A primer	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.		Forward primer (5’-3’): AAGGCGGTGTGGTGGTTCG; Reverse primer (5’-3’): GATTTTGGTCTCTTTGTCACGGTT
TMEM200A SiRNA1	MiaoLing Plasmid		Forward primer (5’-3’): ACAACTGATGATAAGACCAG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGACTACTATTCTGGTC
TMEM200A SiRNA2	MiaoLing Plasmid		Forward primer (5’-3’): CGTGTGAATGTCAATGACTG; Reverse primer (5’-3’): GCACACTTACAGTTACTGAC
TMEM200A SiRNA3	MiaoLing Plasmid		Forward primer (5’-3’): ACAACCACAACATCTGCCCG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGGTGTTGTAGACGGGC
Transmembrane protein 200A Antibody	Proteintech Group, Inc	48081-1
Equipment
CO2 cell culture incubator	Haier Group	PYXE-80IR
Electrophoresis instrument	Bio-RAD
Fluorescence quantitative PCR instrument	Bio-RAD
Gel Imaging System (Tanon 5200)	Tanon Science & Technology Co., Ltd	LAB-0002-0007-SHTN
Multifunctional Enzyme Labeler	Berthold