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  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Neste estudo, um novo método de expressão gênica e edição gênica mediado por Agrobacterium foi desenvolvido em bambu. Este método melhorou muito a eficiência da validação da função gênica em bambu, o que tem implicações significativas para acelerar o processo de criação de bambu.

Abstract

Um novo método de transformação gênica em plantas foi desenvolvido para o bambu, o que evita a necessidade de processos demorados e trabalhosos de indução e regeneração de calos. Este método envolve a expressão gênica mediada por Agrobacterium via ferimento e vácuo para mudas de bambu. Demonstrou com sucesso a expressão de genes exógenos, como o RUBY reporter e o gene Cas9 , em folhas de bambu. A maior eficiência de transformação para o acúmulo de betalaína em mudas de RUBI foi obtida com o uso da linhagem GV3101, com percentual de 85,2% após a infecção. Embora o DNA estranho não tenha se integrado ao genoma do bambu, o método foi eficiente na expressão dos genes exógenos. Além disso, um sistema de edição genética também foi desenvolvido com um repórter nativo usando esse método, a partir do qual um mutante in situ gerado pelo gene editado da violaxantina desepoxidase de bambu (PeVDE) em folhas de bambu, com uma taxa de mutação de 17,33%. A mutação do PeVDE resultou na diminuição dos valores de têmpera não fotoquímica (NPQ) sob luz alta, que pode ser detectada com precisão por um fluorômetro. Isso torna o PeVDE editado um potencial repórter nativo para genes exógenos e endógenos em bambu. Com o repórter do PeVDE, um gene da cinamoil-CoA redutase foi editado com sucesso com uma taxa de mutação de 8,3%. Esta operação evita o processo de cultura de tecidos ou indução de calos, que é rápido e eficiente para expressar genes exógenos e edição de genes endógenos em bambu. Este método pode melhorar a eficiência da verificação da função gênica e ajudará a revelar os mecanismos moleculares das principais vias metabólicas no bambu.

Introduction

A investigação da função gênica no bambu é uma grande promessa para a compreensão avançada do bambu e para o desvendamento de seu potencial de modificação genética. Uma maneira eficaz disso pode ser alcançada através do processo de infecção mediada por Agrobacterium em folhas de bambu, pelo qual o fragmento de T-DNA contendo genes exógenos é introduzido nas células, levando posteriormente à expressão dos genes dentro das células foliares.

O bambu é um recurso valioso e renovável com uma ampla gama de aplicações na fabricação, arte e pesquisa. O bambu possui excelentes propriedades da madeira, como alta resistência mecânica, tenacid....

Protocol

1. Preparo de mudas de bambu

  1. Preparar mudas de bambu moso (Phyllostachys edulis) usando sementes colhidas em Guilin, Guangxi, China. Comece mergulhando as sementes em água por 2-3 dias, certificando-se de trocar a água diariamente. Em seguida, crie um substrato misturando solo e vermiculita em uma proporção de 3:1.
  2. Semear as sementes embebidas no substrato para germinação. Manter as mudas em condições de laboratório, mantendo a temperatura entre 18-25 °C. Garanta u.......

Representative Results

Expressão gênica mediada por agrobactérias em plantas em folhas de bambu
O gene repórter RUBY demonstrou ser eficaz na visualização da expressão gênica transitória devido à sua capacidade de produzir betalaína vermelha vívida a partir da tirosina10. Neste estudo, a transformação mediada por Agrobacterium foi utilizada para expressar transitoriamente o gene exógeno RUBI em folhas de bambu (Figura 1<.......

Discussion

Este método reduz significativamente o tempo necessário em comparação com os métodos tradicionais de transformação genética, que normalmente levam 1-2 anos, e alcança a expressão transitória de genes exógenos e edição gênica de genes endógenos dentro de 5 dias. No entanto, este método tem limitações, pois só pode transformar uma pequena proporção de células, e as folhas editadas por genes são quiméricas e não têm a capacidade de se regenerar em plantas completas. No entanto, esta tecnologia de .......

Disclosures

Os autores declaram não ter interesses concorrentes.

Acknowledgements

Os autores gostariam de agradecer ao Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento da China (Grant No. 2021YFD2200502), à National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31971736) pelo apoio financeiro.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
35S::RUBYAddgene, United States160908Plamid construct
Agrobacterium competent cells of GV3101, EHA105,LBA4404, and AGL1Biomed, ChinaBC304-01, BC303-01, BC301-01, and BC302-01For Agrobacterium infection
CTABSigma-Aldrich, United States57-09-0DNA extraction
Imaging-PAM fluorometerWalz, Effeltrich, GermanyDetect chlorophyll fluorescence of bamboo leaves
ImagingWinWalz, Effeltrich, GermanySoftware for Imaging-PAM fluorometer
Paq CI or Aar INEB, United StatesR0745SIncorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector.
PrimeSTAR Max DNA polymeraseTakara, JapanR045QFor gene cloning
T4 DNA ligaseNEB, United StatesM0202VIncorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector.

References

Reprints and Permissions

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In Planta Gene ExpressionEdi o de GenesMoso Bamboo LeavesAgrobacterium mediated Gene TransformationRUBY ReporterCas9 GeneTransformation EfficiencyBetalain AccumulationGV3101 StrainForeign DNA IntegrationGene Violaxantina De epoxidase de BambuTaxa de Muta oValores de T mpera N o Fotoqu mica NPQDetec o de Fluor metroNative ReporterGene Cinnamoil CoA Redutase

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