Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

В этом исследовании был разработан новый метод экспрессии генов in planta и редактирования генов, опосредованный агробактериями , в бамбуке. Этот метод значительно повысил эффективность валидации функций генов у бамбука, что имеет значительные последствия для ускорения процесса размножения бамбука.

Abstract

Для бамбука был разработан новый метод трансформации генов in planta , который позволяет избежать необходимости в длительных и трудоемких процессах индукции и регенерации каллуса. Этот метод включает в себя экспрессию генов, опосредованную агробактериями, через ранение и вакуум для саженцев бамбука. Он успешно продемонстрировал экспрессию экзогенных генов, таких как репортер RUBY и ген Cas9 , в листьях бамбука. Наибольшая эффективность трансформации для накопления беталаина в проростках RUBY была достигнута при использовании штамма GV3101, с процентом 85,2% после заражения. Несмотря на то, что чужеродная ДНК не интегрировалась в геном бамбука, метод оказался эффективным в экспрессии экзогенных генов. Кроме того, с использованием этого метода была разработана система редактирования генов, из которой был получен мутант in situ , сгенерированный отредактированным геном бамбуковой виолаксантиндеэпоксидазы (PeVDE) в листьях бамбука с частотой мутаций 17,33%. Мутация гена PeVDE привела к снижению значений нефотохимического тушения (NPQ) при сильном освещении, что может быть точно обнаружено флуориметром. Это делает отредактированный PeVDE потенциальным нативным репортером как для экзогенных, так и для эндогенных генов бамбука. С помощью репортера PeVDE был успешно отредактирован ген циннамоил-КоА-редуктазы с частотой мутаций 8,3%. Эта операция позволяет избежать процесса культивирования тканей или индукции каллуса, что является быстрым и эффективным для экспрессии экзогенных генов и эндогенного редактирования генов в бамбуке. Этот метод может повысить эффективность верификации функций генов и поможет выявить молекулярные механизмы ключевых метаболических путей в бамбуке.

Introduction

Исследование функции генов бамбука имеет большие перспективы для углубленного понимания бамбука и раскрытия его потенциала для генетической модификации. Эффективный способ достижения этой цели может быть достигнут с помощью процесса агробактериальной инфекции в листьях бамбука, при котором фрагмент Т-ДНК, содержащий экзогенные гены, вводится в клетки, что впоследствии приводит к экспрессии генов в клетках листьев.

Бамбук является ценным и возобновляемым ресурсом с широким спектром применения в производстве, искусстве и исследованиях. Бамбук обладает превосходными свойствами древесины, такими как высокая механическая прочность, удар....

Protocol

1. Подготовка саженцев бамбука

  1. Подготовьте саженцы бамбука мосо (Phyllostachys edulis), используя семена, собранные в Гуйлине, Гуанси, Китай. Начните с замачивания семян в воде на 2-3 дня, обязательно меняя воду ежедневно. Далее создают субстрат, смешивая грунт и вермикулит в проп.......

Representative Results

Агробактерии, опосредованные экспрессией гена planta в листьях бамбука
Было продемонстрировано, что репортерный ген RUBY эффективен в визуализации транзиторной экспрессии генов благодаря его способности продуцировать ярко-красный беталаин из тирозина1.......

Discussion

Этот метод значительно сокращает необходимое время по сравнению с традиционными методами генетической трансформации, которые обычно занимают 1-2 года, и обеспечивает транзиторную экспрессию экзогенных генов и редактирование генов эндогенных генов в течение 5 дней. Тем не менее, этот м?.......

Acknowledgements

Авторы выражают благодарность за финансовую поддержку Национальной программе ключевых исследований и разработок Китая (грант No 2021YFD2200502), Национальному фонду естественных наук Китая (грант No 31971736).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
35S::RUBYAddgene, United States160908Plamid construct
Agrobacterium competent cells of GV3101, EHA105,LBA4404, and AGL1Biomed, ChinaBC304-01, BC303-01, BC301-01, and BC302-01For Agrobacterium infection
CTABSigma-Aldrich, United States57-09-0DNA extraction
Imaging-PAM fluorometerWalz, Effeltrich, GermanyDetect chlorophyll fluorescence of bamboo leaves
ImagingWinWalz, Effeltrich, GermanySoftware for Imaging-PAM fluorometer
Paq CI or Aar INEB, United StatesR0745SIncorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector.
PrimeSTAR Max DNA polymeraseTakara, JapanR045QFor gene cloning
T4 DNA ligaseNEB, United StatesM0202VIncorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector.

References

Explore More Articles

plantaRUBY ReporterCas9GV3101NPQ

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved