Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

В этом исследовании был разработан новый метод экспрессии генов in planta и редактирования генов, опосредованный агробактериями , в бамбуке. Этот метод значительно повысил эффективность валидации функций генов у бамбука, что имеет значительные последствия для ускорения процесса размножения бамбука.

Abstract

Для бамбука был разработан новый метод трансформации генов in planta , который позволяет избежать необходимости в длительных и трудоемких процессах индукции и регенерации каллуса. Этот метод включает в себя экспрессию генов, опосредованную агробактериями, через ранение и вакуум для саженцев бамбука. Он успешно продемонстрировал экспрессию экзогенных генов, таких как репортер RUBY и ген Cas9 , в листьях бамбука. Наибольшая эффективность трансформации для накопления беталаина в проростках RUBY была достигнута при использовании штамма GV3101, с процентом 85,2% после заражения. Несмотря на то, что чужеродная ДНК не интегрировалась в геном бамбука, метод оказался эффективным в экспрессии экзогенных генов. Кроме того, с использованием этого метода была разработана система редактирования генов, из которой был получен мутант in situ , сгенерированный отредактированным геном бамбуковой виолаксантиндеэпоксидазы (PeVDE) в листьях бамбука с частотой мутаций 17,33%. Мутация гена PeVDE привела к снижению значений нефотохимического тушения (NPQ) при сильном освещении, что может быть точно обнаружено флуориметром. Это делает отредактированный PeVDE потенциальным нативным репортером как для экзогенных, так и для эндогенных генов бамбука. С помощью репортера PeVDE был успешно отредактирован ген циннамоил-КоА-редуктазы с частотой мутаций 8,3%. Эта операция позволяет избежать процесса культивирования тканей или индукции каллуса, что является быстрым и эффективным для экспрессии экзогенных генов и эндогенного редактирования генов в бамбуке. Этот метод может повысить эффективность верификации функций генов и поможет выявить молекулярные механизмы ключевых метаболических путей в бамбуке.

Introduction

Исследование функции генов бамбука имеет большие перспективы для углубленного понимания бамбука и раскрытия его потенциала для генетической модификации. Эффективный способ достижения этой цели может быть достигнут с помощью процесса агробактериальной инфекции в листьях бамбука, при котором фрагмент Т-ДНК, содержащий экзогенные гены, вводится в клетки, что впоследствии приводит к экспрессии генов в клетках листьев.

Бамбук является ценным и возобновляемым ресурсом с широким спектром применения в производстве, искусстве и исследованиях. Бамбук обладает превосходными свойствами древесины, такими как высокая механическая прочность, удар....

Protocol

1. Подготовка саженцев бамбука

  1. Подготовьте саженцы бамбука мосо (Phyllostachys edulis), используя семена, собранные в Гуйлине, Гуанси, Китай. Начните с замачивания семян в воде на 2-3 дня, обязательно меняя воду ежедневно. Далее создают субстрат, смешивая грунт и вермикулит в проп.......

Representative Results

Агробактерии, опосредованные экспрессией гена planta в листьях бамбука
Было продемонстрировано, что репортерный ген RUBY эффективен в визуализации транзиторной экспрессии генов благодаря его способности продуцировать ярко-красный беталаин из тирозина1.......

Discussion

Этот метод значительно сокращает необходимое время по сравнению с традиционными методами генетической трансформации, которые обычно занимают 1-2 года, и обеспечивает транзиторную экспрессию экзогенных генов и редактирование генов эндогенных генов в течение 5 дней. Тем не менее, этот м?.......

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

Acknowledgements

Авторы выражают благодарность за финансовую поддержку Национальной программе ключевых исследований и разработок Китая (грант No 2021YFD2200502), Национальному фонду естественных наук Китая (грант No 31971736).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
35S::RUBYAddgene, United States160908Plamid construct
Agrobacterium competent cells of GV3101, EHA105,LBA4404, and AGL1Biomed, ChinaBC304-01, BC303-01, BC301-01, and BC302-01For Agrobacterium infection
CTABSigma-Aldrich, United States57-09-0DNA extraction
Imaging-PAM fluorometerWalz, Effeltrich, GermanyDetect chlorophyll fluorescence of bamboo leaves
ImagingWinWalz, Effeltrich, GermanySoftware for Imaging-PAM fluorometer
Paq CI or Aar INEB, United StatesR0745SIncorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector.
PrimeSTAR Max DNA polymeraseTakara, JapanR045QFor gene cloning
T4 DNA ligaseNEB, United StatesM0202VIncorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector.

References

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

plantaRUBY ReporterCas9GV3101NPQ

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved