A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
תכנות מחדש של אדנוקרצינומה של צינור הלבלב לפלוריפוטנציה
In This Article
Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר תכנות מחדש של אדנוקרצינומה צינורית לבלב (PDAC) ותאי אפיתל צינור לבלב נורמליים לתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs). אנו מספקים הליך אופטימלי ומפורט, שלב אחר שלב, החל מהכנת lentivirus ועד הקמת קווי iPSC יציבים.
Abstract
יצירת תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) באמצעות גורמי שעתוק הושגה כמעט מכל סוג תא ממוין והוכחה כבעלת ערך רב למחקר וליישומים קליניים. באופן מעניין, הוכח כי תכנות מחדש של תאי סרטן iPSC, כגון אדנוקרצינומה של צינור הלבלב (PDAC), מחזיר לאחור את הפנוטיפ הפולשני של PDAC וגובר על אפיגנום הסרטן. ההתמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים שמקורם ב-PDAC יכולה לשחזר את התקדמות PDAC מהמבשר המוקדם של הניאופלזיה התוך-אפיתליאלית של הלבלב (PanIN), ולחשוף את השינויים המולקולריים והתאיים המתרחשים בשלב מוקדם במהלך התקדמות PDAC. לכן, ניתן להשתמש בתאי גזע מושרים שמקורם ב-PDAC כדי למדל את השלבים המוקדמים ביותר של PDAC לגילוי סמני אבחון לגילוי מוקדם. זה חשוב במיוחד עבור חולי PDAC, אשר מאובחנים בדרך כלל בשלבים גרורתיים מאוחרים בשל מחסור בסמנים ביולוגיים אמינים עבור שלבי PanIN מוקדמים יותר. עם זאת, תכנות מחדש של קווי תאים סרטניים, כולל PDAC, לפלוריפוטנציה נותר מאתגר, דורש עבודה רבה ומשתנה מאוד בין קווים שונים. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול עקבי יותר ליצירת תאי iPSC מקווי תאי PDAC אנושיים שונים באמצעות וקטורים לנטי-ויראליים דו-גלגליים. קווי iPSC המתקבלים יציבים, ואינם מראים תלות בביטוי אקסוגני של גורמי תכנות מחדש או תרופות אינדוקטיביות. בסך הכל, פרוטוקול זה מאפשר יצירה של מגוון רחב של iPSCs שמקורם ב-PDAC, שהוא חיוני לגילוי סמנים ביולוגיים מוקדמים שהם ספציפיים יותר ומייצגים מקרי PDAC.
Introduction
אדנוקרצינומה של צינור הלבלב (PDAC) היא אחת הממאירויות הקטלניות ביותר, ואבחון מוקדם נותר מאתגר בשל האופי האסימפטומטי של המחלה. רוב חולי PDAC מאובחנים בשלב גרורתי מתקדם כאשר אפשרויות הטיפול מוגבלות מאוד זמינות 1,2. זה בעיקר בשל היעדר סמנים ביולוגיים אמינים עבור השלבים המוקדמים יותר, כגון אלה שניתן לזהות בנוחות כמו חלבונים שוחררו לתוך זרם הדם.
PDAC יכול להתפשט מוקדם מאוד במהלך התקדמותו, ופרוגנוזה טובה יותר נקשרה לגילוי מוקדם של סרטן כאשר PDAC ממוקם בלבלב3. עם זאת, פחות מעשירית מחולי PDAC מאובחנים עם פרוגנוזה חיובית, המאפשרת כריתה כירורגית. עם זאת, מעטים עם גידול....
Protocol
כל הפרוטוקולים הניסיוניים אושרו על ידי מועצת הביקורת המוסדית של OHSU. כל השיטות בוצעו בהתאם להנחיות ולתקנות הרלוונטיות. כל העבודות בבעלי חיים עבור גידולי PDX בוצעו באישור הוועדה המוסדית לשימוש וטיפול בבעלי חיים של OHSU (IACUC). פרוטוקול זה נבדק בתאי PDAC ראשוניים מקסנוגרפט שמקורו במטופל (PDX), קו תאי B.......
Representative Results
תמונות מייצגות המציגות את המורפולוגיה של מושבות iPSC שמקורן בתאי PDAC, BXPc3, H6C7 ו-hFib מוצגות באיור 1. מושבות PDAC-iPSC החלו להיווצר ביום ה-25 של התכנות מחדש. מושבות iPSC חזקות עם מורפולוגיה מבוססת יותר דמוית ESC זוהו ביום 40 של תכנות מחדש (איור 1). באופן דומה, ?.......
Discussion
כדי להקל על השימוש בתכנות מחדש של iPSC לחקר התקדמות הסרטן, נקבע פרוטוקול חזק לתכנות מחדש של תאי סרטן הלבלב. תכנות מחדש של תאים סרטניים לפלוריפוטנציה הוכח כמאתגר מאוד עד כה, שכן רק מחקרים מעטים יצרו בהצלחה iPSCs מתאי סרטן 32,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46
Acknowledgements
A.S ו- J.K רוצים להודות לחקר הסרטן בבריטניה ול- OHSU על המימון (פרס פרויקט CRUK-OHSU C65925/A26986). A.S נתמך על ידי פרס פיתוח קריירה של MRC (MR/N024028/1). A.A ממומן על ידי מלגת דוקטורט (מלגה מס' 1078107040) מהעיר המלך עבד אל-עזיז למדע וטכנולוגיה. J.K ממומן על ידי MRF New Investigator Grant (GCNCR1042A) ומענק Knight CEDAR (68182-933-000, 68182-939-000). אנו מודים לפרופ' קייסוקה קאג'י על שסיפק באדיבות את וקטור התכנות מחדש pSIN4-EF1a-O2S ו- pSIN4-CMV-K2M. לצורך גישה פתוחה, המחבר החיל רישיון Creative Commons Attribution (CC BY) על כל גרסה של כתב היד המקובל על המחבר הנובעת מהגשה זו.
....Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol (50 mM) | Thermo Fisher | 31350010 | |
| Alexa Fluor 488 anti- human TRA-1-60-R | BioLegend | 330613 | |
| Bovine Pituitary Extract (BPE) | Thermo Fisher | 13028014 | |
| BxPc3 | ATCC | CRL-1687 | |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Merck | C8052-1MG | |
| Collagen, Type I solution from rat tail | Merck | C3867 | |
| Completed Defined K-SFM | Thermo Fisher | 10744-019 | |
| Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plates | Merck | CLS3516 | |
| Corning syringe filters | Merck | CLS431231 | |
| Corning tissue-culture treated culture dishes | Merck | CLS430599 | |
| Day Impex Virkon Disinfectant Virucidal Tablets | Thermo Fisher | 12328667 | |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Merck | D8537 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Thermo Fisher | 10270-106 | |
| Fugene HD Transfection Reagent | Promega | E2312 | |
| Gelatin solution, Type B, 2% in H2O | Merck | G1393-100ML | |
| Glasgow Minimum Essential Media (GMEM) | Merck | G5154 | |
| Human EGF Recombinant Protein | Thermo Fisher | PHG0311 | |
| Human FGF-basic (FGF-2/bFGF) (154 aa) Recombinant Protein, PeproTech | Thermo Fisher | 100-18B | |
| Human Pancreatic Duct Epithelial Cell Line (H6c7) | Kerafast | ECA001-FP | |
| iMEF feeder cells | iXcells Biotechnologies | 10MU-001-1V | |
| Keratinocyte Serum Free Media (KSFM) | Thermo Fisher | 17005-042 | |
| KnockOut DMEM | Thermo Fisher | 10829018 | |
| KnockOut serum Replacement | Thermo Fisher | 10828028 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher | 25030-024 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher | 11140050 | |
| Millex-HP 0.45 μM syringe Filter Unit (Sterile) | Merck | SLHP033RS | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985062 | |
| pMDG | AddGene | 187440 | |
| Polybrene (Hexadimethrine bromide) | Merck | H9268-5G | |
| pSIN4-CMV-K2M | AddGene | 21164 | |
| pSIN4-EF2-O2S | AddGene | 21162 | |
| psPAX2 | AddGene | 12260 | |
| pWPT-GFP | AddGene | 12255 | |
| RPMI 1640 Medium (ATCC modification) | Thermo Fisher | A1049101 | |
| Sodym Pyruvate | Thermo Fisher | 11360-039 | |
| Sterile Syringes for Single Use (60 mL) | Thermo Fisher | 15899152 | |
| TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red | Thermo Fisher | 12605036 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | |
| Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL Technologies | 72304 |
References
- Rahib, L., et al. Projecting cancer incidence and deaths to 2030: the unexpected burden of thyroid, liver, and pancreas cancers in the United States. Cancer Research. 74 (11), 2913-2921 (2014).
- Hu, J. X., et al.
Explore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved