Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר תכנות מחדש של אדנוקרצינומה צינורית לבלב (PDAC) ותאי אפיתל צינור לבלב נורמליים לתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs). אנו מספקים הליך אופטימלי ומפורט, שלב אחר שלב, החל מהכנת lentivirus ועד הקמת קווי iPSC יציבים.

Abstract

יצירת תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) באמצעות גורמי שעתוק הושגה כמעט מכל סוג תא ממוין והוכחה כבעלת ערך רב למחקר וליישומים קליניים. באופן מעניין, הוכח כי תכנות מחדש של תאי סרטן iPSC, כגון אדנוקרצינומה של צינור הלבלב (PDAC), מחזיר לאחור את הפנוטיפ הפולשני של PDAC וגובר על אפיגנום הסרטן. ההתמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים שמקורם ב-PDAC יכולה לשחזר את התקדמות PDAC מהמבשר המוקדם של הניאופלזיה התוך-אפיתליאלית של הלבלב (PanIN), ולחשוף את השינויים המולקולריים והתאיים המתרחשים בשלב מוקדם במהלך התקדמות PDAC. לכן, ניתן להשתמש בתאי גזע מושרים שמקורם ב-PDAC כדי למדל את השלבים המוקדמים ביותר של PDAC לגילוי סמני אבחון לגילוי מוקדם. זה חשוב במיוחד עבור חולי PDAC, אשר מאובחנים בדרך כלל בשלבים גרורתיים מאוחרים בשל מחסור בסמנים ביולוגיים אמינים עבור שלבי PanIN מוקדמים יותר. עם זאת, תכנות מחדש של קווי תאים סרטניים, כולל PDAC, לפלוריפוטנציה נותר מאתגר, דורש עבודה רבה ומשתנה מאוד בין קווים שונים. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול עקבי יותר ליצירת תאי iPSC מקווי תאי PDAC אנושיים שונים באמצעות וקטורים לנטי-ויראליים דו-גלגליים. קווי iPSC המתקבלים יציבים, ואינם מראים תלות בביטוי אקסוגני של גורמי תכנות מחדש או תרופות אינדוקטיביות. בסך הכל, פרוטוקול זה מאפשר יצירה של מגוון רחב של iPSCs שמקורם ב-PDAC, שהוא חיוני לגילוי סמנים ביולוגיים מוקדמים שהם ספציפיים יותר ומייצגים מקרי PDAC.

Introduction

אדנוקרצינומה של צינור הלבלב (PDAC) היא אחת הממאירויות הקטלניות ביותר, ואבחון מוקדם נותר מאתגר בשל האופי האסימפטומטי של המחלה. רוב חולי PDAC מאובחנים בשלב גרורתי מתקדם כאשר אפשרויות הטיפול מוגבלות מאוד זמינות 1,2. זה בעיקר בשל היעדר סמנים ביולוגיים אמינים עבור השלבים המוקדמים יותר, כגון אלה שניתן לזהות בנוחות כמו חלבונים שוחררו לתוך זרם הדם.

PDAC יכול להתפשט מוקדם מאוד במהלך התקדמותו, ופרוגנוזה טובה יותר נקשרה לגילוי מוקדם של סרטן כאשר PDAC ממוקם בלבלב3. עם זאת, פחות מעשירית מחולי PDAC מאובחנים עם פרוגנוזה חיובית, המאפשרת כריתה כירורגית. עם זאת, מעטים עם גידול....

Protocol

כל הפרוטוקולים הניסיוניים אושרו על ידי מועצת הביקורת המוסדית של OHSU. כל השיטות בוצעו בהתאם להנחיות ולתקנות הרלוונטיות. כל העבודות בבעלי חיים עבור גידולי PDX בוצעו באישור הוועדה המוסדית לשימוש וטיפול בבעלי חיים של OHSU (IACUC). פרוטוקול זה נבדק בתאי PDAC ראשוניים מקסנוגרפט שמקורו במטופל (PDX), קו תאי B.......

Representative Results

תמונות מייצגות המציגות את המורפולוגיה של מושבות iPSC שמקורן בתאי PDAC, BXPc3, H6C7 ו-hFib מוצגות באיור 1. מושבות PDAC-iPSC החלו להיווצר ביום ה-25 של התכנות מחדש. מושבות iPSC חזקות עם מורפולוגיה מבוססת יותר דמוית ESC זוהו ביום 40 של תכנות מחדש (איור 1). באופן דומה, ?.......

Discussion

כדי להקל על השימוש בתכנות מחדש של iPSC לחקר התקדמות הסרטן, נקבע פרוטוקול חזק לתכנות מחדש של תאי סרטן הלבלב. תכנות מחדש של תאים סרטניים לפלוריפוטנציה הוכח כמאתגר מאוד עד כה, שכן רק מחקרים מעטים יצרו בהצלחה iPSCs מתאי סרטן 32,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46

Acknowledgements

A.S ו- J.K רוצים להודות לחקר הסרטן בבריטניה ול- OHSU על המימון (פרס פרויקט CRUK-OHSU C65925/A26986). A.S נתמך על ידי פרס פיתוח קריירה של MRC (MR/N024028/1). A.A ממומן על ידי מלגת דוקטורט (מלגה מס' 1078107040) מהעיר המלך עבד אל-עזיז למדע וטכנולוגיה. J.K ממומן על ידי MRF New Investigator Grant (GCNCR1042A) ומענק Knight CEDAR (68182-933-000, 68182-939-000). אנו מודים לפרופ' קייסוקה קאג'י על שסיפק באדיבות את וקטור התכנות מחדש pSIN4-EF1a-O2S ו- pSIN4-CMV-K2M. לצורך גישה פתוחה, המחבר החיל רישיון Creative Commons Attribution (CC BY) על כל גרסה של כתב היד המקובל על המחבר הנובעת מהגשה זו.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2-Mercaptoethanol (50 mM)Thermo Fisher31350010
Alexa Fluor 488 anti- human TRA-1-60-RBioLegend330613
Bovine Pituitary Extract (BPE)Thermo Fisher13028014
BxPc3ATCCCRL-1687
Cholera Toxin from Vibrio choleraeMerck C8052-1MG
Collagen, Type I solution from rat tailMerck C3867
Completed Defined K-SFMThermo Fisher 10744-019
Corning Costar TC-Treated Multiple Well PlatesMerck CLS3516
Corning syringe filtersMerck CLS431231
Corning tissue-culture treated culture dishesMerck CLS430599
Day Impex Virkon Disinfectant Virucidal TabletsThermo Fisher12328667
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS)Merck D8537
Fetal Calf Serum (FCS) Thermo Fisher10270-106
Fugene HD Transfection Reagent Promega  E2312
Gelatin solution, Type B, 2% in H2OMerck G1393-100ML
Glasgow Minimum Essential Media (GMEM)Merck G5154
Human EGF Recombinant ProteinThermo FisherPHG0311
Human FGF-basic (FGF-2/bFGF) (154 aa) Recombinant Protein, PeproTechThermo Fisher100-18B
Human Pancreatic Duct Epithelial Cell Line (H6c7)KerafastECA001-FP
iMEF feeder cells iXcells Biotechnologies10MU-001-1V
Keratinocyte Serum Free Media (KSFM) Thermo Fisher17005-042
KnockOut DMEM Thermo Fisher10829018
KnockOut serum Replacement Thermo Fisher10828028
L-Glutamine (200 mM)Thermo Fisher25030-024
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)Thermo Fisher11140050
Millex-HP 0.45 μM syringe Filter Unit (Sterile)Merck SLHP033RS
Opti-MEM Reduced Serum Medium Thermo Fisher31985062
pMDG AddGene187440
Polybrene (Hexadimethrine bromide) Merck H9268-5G
pSIN4-CMV-K2M AddGene21164
pSIN4-EF2-O2S AddGene21162
psPAX2AddGene12260
pWPT-GFP AddGene12255
RPMI 1640 Medium (ATCC modification)Thermo FisherA1049101
Sodym PyruvateThermo Fisher11360-039
Sterile Syringes for Single Use (60 mL) Thermo Fisher15899152
TrypLE Express Enzyme (1x), phenol redThermo Fisher12605036
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0Thermo Fisher15575020
Y-27632 (Dihydrochloride)STEMCELL Technologies72304

References

Explore More Articles

204

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved