Desenvolvimento de ensaios RT-qPCR multiplex em tempo real para a detecção de SARS-CoV-2, Influenza A/B e MERS-CoV

Summary

Apresentamos dois kits internos de RT-qPCR de uma etapa baseados em sonda para vírus respiratórios comuns. O primeiro ensaio é para SARS-CoV-2 (N), Influenza A (H1N1 e H3N2) e Influenza B. O segundo é para SARS-Cov-2 (N) e MERS (UpE e ORF1a). Estes ensaios podem ser implementados com sucesso em qualquer laboratório especializado.

Abstract

O coronavírus 2 da síndrome respiratória aguda grave (SARS-CoV-2) que causa a doença 2019 do coronavirus (COVID-19) é uma séria ameaça à saúde pública em geral. Durante as temporadas de gripe, a disseminação do SARS-CoV-2 e de outros vírus respiratórios pode causar uma carga populacional de doença respiratória difícil de controlar. Para isso, os vírus respiratórios SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B e Síndrome Respiratória do Oriente Médio (MERS-CoV) precisarão ser cuidadosamente observados nas próximas temporadas de outono e inverno, particularmente no caso do SARS-CoV-2, Influenza A e Influenza B, que compartilham fatores epidemiológicos semelhantes, como populações suscetíveis, modo de transmissão e síndromes clínicas. Sem ensaios alvo-específicos, pode ser difícil diferenciar entre os casos desses vírus devido às suas semelhanças. Assim, um ensaio multiplex sensível e direcionado que possa facilmente diferenciar entre esses alvos virais será útil para os profissionais de saúde. Neste estudo, nós desenvolvemos um ensaio baseado em transcriptase reversa em tempo real utilizando um kit RT-qPCR de uma etapa R3T desenvolvido internamente para detecção simultânea de SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B, e SARS-CoV-2, MERS-CoV. Com apenas 10 cópias de seus RNAs sintéticos, podemos identificar com sucesso alvos SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B e MERS-CoV simultaneamente com 100% de especificidade. Este ensaio é encontrado para ser preciso, confiável, simples, sensível e específico. O método desenvolvido pode ser usado como um ensaio de diagnóstico SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B e SARS-CoV-2 otimizado em hospitais, centros médicos e laboratórios de diagnóstico, bem como para fins de pesquisa.

Introduction

A pandemia da doença 2019 do coronavirus em curso (COVID-19) é causada pelo novo coronavirus conhecido como coronavirus 2 da síndrome respiratória aguda grave (SARS-CoV-2)¹. Devido à forte contagiosidade do SAR-CoV-2 e à capacidade de transmissão rápida, a pandemia de COVID-19 surgiu na cidade de Wuhan, na China, e se espalhou rapidamente pelo mundo. Isso acabou levando ao aparecimento de sinais de desconforto respiratório e até mesmo à morte ^2,3,4. A COVID-19 foi declarada pandemia em mais de 213 países, esperando-se um aumento acentuado no número de ....

Protocol

1. Expressão e purificação da Taq polimerase

1. Construir um plasmídeo com uma etiqueta hexa-histidina clivável no término C da enzima.
2. Transformar 50 ng do vetor de expressão em cepa de E. coli BL21-(DE3) seguindo o protocolo padrão³⁸.
3. Inocular as células transformadas em quatro frascos de 6 L cada um contendo 2 L de caldo de meio 2YT a 37 °C com agitação a 170 rpm até atingir o OD 600 de 0,8 ou o número de célula 6,4 x 10^8<.......

Discussion

Há uma pesada carga econômica sobre o sistema de saúde em todo o mundo resultante das altas taxas de infecção e mortalidade devido à disseminação de vírus respiratórios comuns, como as variantes SARS-CoV-2, Influenza A/B e MERS-CoV 12,19,20. Motivados pelo senso de responsabilidade em aliviar essa carga, percebemos a necessidade de um ensaio diagnóstico rápido, preciso e acessível, como o RT-qPCR, para distinguir en.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 μm filter cups	Thermo Scientific	291-4545
10X Tris-Glycine SDS running buffer	Novex	LC2675
6-well tissue culturing plates	Corning	353046
Ammonium sulfate	Fisher Scientific	A701-3
Ampicillin	Corning	61-238-RH
Cation exchange (HiTrap SP HP) 5 mL	Cytiva	17-1152-01
D-(+)-Biotin, 98+%	Thermo Scientific	A14207.60
DH10Bac competent cells	Fisher Scientific	10361012
Dialysis bag (Snakeskin 10,000 MWC)	Thermo Scientific	68100
Dithiothreitol (DTT)	Thermo Scientific	R0862
Dnase/Rnase Free Distilled Water	Ambion	AM9930
dNTPs	Thermo Scientific	R0192
E. coli BL21(DE3) competent cells	Invitrogen	C600003
EDTA	Fisher Scientific	BP120-1
Elution Buffer	Qiagen	19086
ESF 921 insect cell culture medium (Insect cells media)	Expression Systems	96-001-01
FBS Solution	Gibco	A38400-01
Fugene (transfection reagent)	Promega	E2311
Gentamicin	Fisher Scientific	15750060
Glycerol	Sigma Aldrich	G5516-500
IGEPAL CA-630	Sigma Aldrich	I8896-100ml
Imidazole	Sigma Aldrich	56750-1Kg
Influenza A (H1N1) synthetic RNA	Twist Bioscience	103001
Influenza A (H3N2)  synthetic RNA	Twist Bioscience	103002
Influenza B synthetic RNA	Twist Bioscience	103003
IPTG	Gold Biotechnology	I3481C100
Kanamycin	Gibco	11815-032
LB Agar	Fisher Scientific	BP1425-500
LB Broth media	Fisher Scientific	BP1426-500
Lysozyme	Sigma Aldrich	L6876-10G
Magnesium Chloride	Sigma Aldrich	13152-1Kg
MERS-CoV synthetic RNA	Twist Bioscience	103015
MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction plates with Barcode (0.1 mL)	Applied Biosystems	10310855
Mini- PROTEAN TGX Precast Gel	Bio-Rad	456-1093
Miniprep kit	Qiagen	27106
Ni-NTA Excel (HisTrap Excel) 5 mL	Cytiva	17-3712-06
Ni-NTA HP (HisTrap HP) 5 mL	Cytiva	17-5248-02
Optical Adhesice Covers (PCR Compatible,DNA/Rnase/PCR Inhibitors Free	Applied Biosystems	4311971
Potassium Chloride	Fisher Bioreagents	BP366-1
Primers and Probes	Integrated DNA Technologies, Inc.
Protease Inhibitor Mini tablets EDTA-Free	Thermo Scientific	A32955
Protein marker	Fermentas	26616
RT-qPCR machine (QuantStudio 7 Flex)	Applied Biosystems
S.O.C medium	Fisher Scientific	15544034
SARS-CoV-+A2:C442 synthetic RNA	Twist Bioscience	102024
Sf9 insect cells	Gibco	A35243
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S3014-1Kg
StrepTrap XT 5 mL	Cytiva	29401323
Tetracycline	IBI Scientific	IB02200
Tris Base Molecular Biology Grade	Promega	H5135
Tris-HCl	Affymetrix	22676
Tween 20	Sigma Aldrich	P1379-100ml
X-Gal	Invitrogen	B1690