A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Мы представляем два собственных одноэтапных набора для ОТ-кПЦР на основе зондов для распространенных респираторных вирусов. Первый анализ проводится на SARS-CoV-2 (N), грипп A (H1N1 и H3N2) и грипп B. Второй — для SARS-Cov-2 (N) и MERS (UpE и ORF1a). Эти анализы могут быть успешно реализованы в любой специализированной лаборатории.
Коронавирус тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2), вызывающий коронавирусную болезнь 2019 года (COVID-19), представляет серьезную угрозу для здоровья населения в целом. Во время сезонов гриппа распространение SARS-CoV-2 и других респираторных вирусов может привести к тяжелому бремени респираторных заболеваний в масштабах всего населения, с которым трудно справиться. Для этого в предстоящие осенние и зимние сезоны необходимо будет тщательно следить за респираторными вирусами SARS-CoV-2, гриппа А, гриппа В и ближневосточного респираторного синдрома (БВРС-КоВ), особенно в случае SARS-CoV-2, гриппа А и гриппа В, которые имеют схожие эпидемиологические факторы, такие как восприимчивые популяции, способ передачи и клинические синдромы. Без таргетно-специфических анализов может быть сложно дифференцировать случаи этих вирусов из-за их сходства. Соответственно, чувствительный и таргетный мультиплексный анализ, который может легко дифференцировать эти вирусные мишени, будет полезен для практикующих врачей. В этом исследовании мы разработали анализ на основе ПЦР с обратной транскриптазой в режиме реального времени с использованием разработанного нами одноэтапного набора R3T RT-qPCR для одновременного выявления SARS-CoV-2, гриппа A, гриппа B и SARS-CoV-2, MERS-CoV. Имея всего 10 копий их синтетических РНК, мы можем успешно идентифицировать мишени SARS-CoV-2, гриппа A, гриппа B и MERS-CoV одновременно со 100% специфичностью. Этот анализ признан точным, надежным, простым, чувствительным и специфичным. Разработанный метод может быть использован в качестве оптимизированного диагностического анализа SARS-CoV-2, гриппа А, гриппа В и SARS-CoV-2, MERS-CoV в больницах, медицинских центрах и диагностических лабораториях, а также в исследовательских целях.
Пандемия продолжающейся коронавирусной инфекции 2019 года (COVID-19) вызвана новым коронавирусом, известным как коронавирус тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2)1. Из-за высокой заразности и способности SAR-CoV-2 к быстрой передаче пандемия COVID-19 возникла в городе Ухань (Китай) и быстро распространилась по всему миру. Это в конечном итоге привело к появлению респираторных дистресс-признаков и даже смерти 2,3,4. COVID-19 был объявлен пандемией более чем в 213 странах, ожидая резкого увеличения числа подтвержденных случаев, о чем сви....
1. Экспрессия и очистка Taq-полимеразы
В последние годы были достигнуты значительные успехи в диагностическом подходе к выявлению распространенных респираторных вирусов с использованием подходов ПЦР 21,22,23,24,25. Однако, несмотря на эти д.......
В связи с распространением распространенных респираторных вирусов, таких как SARS-CoV-2, грипп A/B и варианты БВРС-КоВ 12,19,20, на систему здравоохранения во всем мире ложится тяжелая экономическая нагрузка. Руководствуясь чувством ответствен.......
Эта работа была поддержана Научно-технологическим университетом имени короля Абдаллы за счет основного финансирования и National Term Grand Challenge (NTGC) для S.M.H.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.45 μm filter cups | Thermo Scientific | 291-4545 | |
10X Tris-Glycine SDS running buffer | Novex | LC2675 | |
6-well tissue culturing plates | Corning | 353046 | |
Ammonium sulfate | Fisher Scientific | A701-3 | |
Ampicillin | Corning | 61-238-RH | |
Cation exchange (HiTrap SP HP) 5 mL | Cytiva | 17-1152-01 | |
D-(+)-Biotin, 98+% | Thermo Scientific | A14207.60 | |
DH10Bac competent cells | Fisher Scientific | 10361012 | |
Dialysis bag (Snakeskin 10,000 MWC) | Thermo Scientific | 68100 | |
Dithiothreitol (DTT) | Thermo Scientific | R0862 | |
Dnase/Rnase Free Distilled Water | Ambion | AM9930 | |
dNTPs | Thermo Scientific | R0192 | |
E. coli BL21(DE3) competent cells | Invitrogen | C600003 | |
EDTA | Fisher Scientific | BP120-1 | |
Elution Buffer | Qiagen | 19086 | |
ESF 921 insect cell culture medium (Insect cells media) | Expression Systems | 96-001-01 | |
FBS Solution | Gibco | A38400-01 | |
Fugene (transfection reagent) | Promega | E2311 | |
Gentamicin | Fisher Scientific | 15750060 | |
Glycerol | Sigma Aldrich | G5516-500 | |
IGEPAL CA-630 | Sigma Aldrich | I8896-100ml | |
Imidazole | Sigma Aldrich | 56750-1Kg | |
Influenza A (H1N1) synthetic RNA | Twist Bioscience | 103001 | |
Influenza A (H3N2) synthetic RNA | Twist Bioscience | 103002 | |
Influenza B synthetic RNA | Twist Bioscience | 103003 | |
IPTG | Gold Biotechnology | I3481C100 | |
Kanamycin | Gibco | 11815-032 | |
LB Agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | |
LB Broth media | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
Lysozyme | Sigma Aldrich | L6876-10G | |
Magnesium Chloride | Sigma Aldrich | 13152-1Kg | |
MERS-CoV synthetic RNA | Twist Bioscience | 103015 | |
MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction plates with Barcode (0.1 mL) | Applied Biosystems | 10310855 | |
Mini- PROTEAN TGX Precast Gel | Bio-Rad | 456-1093 | |
Miniprep kit | Qiagen | 27106 | |
Ni-NTA Excel (HisTrap Excel) 5 mL | Cytiva | 17-3712-06 | |
Ni-NTA HP (HisTrap HP) 5 mL | Cytiva | 17-5248-02 | |
Optical Adhesice Covers (PCR Compatible,DNA/Rnase/PCR Inhibitors Free | Applied Biosystems | 4311971 | |
Potassium Chloride | Fisher Bioreagents | BP366-1 | |
Primers and Probes | Integrated DNA Technologies, Inc. | ||
Protease Inhibitor Mini tablets EDTA-Free | Thermo Scientific | A32955 | |
Protein marker | Fermentas | 26616 | |
RT-qPCR machine (QuantStudio 7 Flex) | Applied Biosystems | ||
S.O.C medium | Fisher Scientific | 15544034 | |
SARS-CoV-+A2:C442 synthetic RNA | Twist Bioscience | 102024 | |
Sf9 insect cells | Gibco | A35243 | |
Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S3014-1Kg | |
StrepTrap XT 5 mL | Cytiva | 29401323 | |
Tetracycline | IBI Scientific | IB02200 | |
Tris Base Molecular Biology Grade | Promega | H5135 | |
Tris-HCl | Affymetrix | 22676 | |
Tween 20 | Sigma Aldrich | P1379-100ml | |
X-Gal | Invitrogen | B1690 |
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved