Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Мы представляем два собственных одноэтапных набора для ОТ-кПЦР на основе зондов для распространенных респираторных вирусов. Первый анализ проводится на SARS-CoV-2 (N), грипп A (H1N1 и H3N2) и грипп B. Второй — для SARS-Cov-2 (N) и MERS (UpE и ORF1a). Эти анализы могут быть успешно реализованы в любой специализированной лаборатории.

Abstract

Коронавирус тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2), вызывающий коронавирусную болезнь 2019 года (COVID-19), представляет серьезную угрозу для здоровья населения в целом. Во время сезонов гриппа распространение SARS-CoV-2 и других респираторных вирусов может привести к тяжелому бремени респираторных заболеваний в масштабах всего населения, с которым трудно справиться. Для этого в предстоящие осенние и зимние сезоны необходимо будет тщательно следить за респираторными вирусами SARS-CoV-2, гриппа А, гриппа В и ближневосточного респираторного синдрома (БВРС-КоВ), особенно в случае SARS-CoV-2, гриппа А и гриппа В, которые имеют схожие эпидемиологические факторы, такие как восприимчивые популяции, способ передачи и клинические синдромы. Без таргетно-специфических анализов может быть сложно дифференцировать случаи этих вирусов из-за их сходства. Соответственно, чувствительный и таргетный мультиплексный анализ, который может легко дифференцировать эти вирусные мишени, будет полезен для практикующих врачей. В этом исследовании мы разработали анализ на основе ПЦР с обратной транскриптазой в режиме реального времени с использованием разработанного нами одноэтапного набора R3T RT-qPCR для одновременного выявления SARS-CoV-2, гриппа A, гриппа B и SARS-CoV-2, MERS-CoV. Имея всего 10 копий их синтетических РНК, мы можем успешно идентифицировать мишени SARS-CoV-2, гриппа A, гриппа B и MERS-CoV одновременно со 100% специфичностью. Этот анализ признан точным, надежным, простым, чувствительным и специфичным. Разработанный метод может быть использован в качестве оптимизированного диагностического анализа SARS-CoV-2, гриппа А, гриппа В и SARS-CoV-2, MERS-CoV в больницах, медицинских центрах и диагностических лабораториях, а также в исследовательских целях.

Introduction

Пандемия продолжающейся коронавирусной инфекции 2019 года (COVID-19) вызвана новым коронавирусом, известным как коронавирус тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2)1. Из-за высокой заразности и способности SAR-CoV-2 к быстрой передаче пандемия COVID-19 возникла в городе Ухань (Китай) и быстро распространилась по всему миру. Это в конечном итоге привело к появлению респираторных дистресс-признаков и даже смерти 2,3,4. COVID-19 был объявлен пандемией более чем в 213 странах, ожидая резкого увеличения числа подтвержденных случаев, о чем сви....

Protocol

1. Экспрессия и очистка Taq-полимеразы

  1. Сконструировать плазмиду с расщепляемой гекса-гистидиновой меткой на С-конце фермента.
  2. Трансформируют 50 нг вектора экспрессии в штамм E. coli BL21-(DE3) в соответствии со стандартным протоколом38.
  3. Высевать трансфо.......

Representative Results

В последние годы были достигнуты значительные успехи в диагностическом подходе к выявлению распространенных респираторных вирусов с использованием подходов ПЦР 21,22,23,24,25. Однако, несмотря на эти д.......

Discussion

В связи с распространением распространенных респираторных вирусов, таких как SARS-CoV-2, грипп A/B и варианты БВРС-КоВ 12,19,20, на систему здравоохранения во всем мире ложится тяжелая экономическая нагрузка. Руководствуясь чувством ответствен.......

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Научно-технологическим университетом имени короля Абдаллы за счет основного финансирования и National Term Grand Challenge (NTGC) для S.M.H.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.45 μm filter cupsThermo Scientific291-4545
10X Tris-Glycine SDS running bufferNovexLC2675
6-well tissue culturing platesCorning353046
Ammonium sulfateFisher ScientificA701-3
AmpicillinCorning61-238-RH
Cation exchange (HiTrap SP HP) 5 mLCytiva17-1152-01
D-(+)-Biotin, 98+%Thermo ScientificA14207.60
DH10Bac competent cellsFisher Scientific10361012
Dialysis bag (Snakeskin 10,000 MWC)Thermo Scientific68100
Dithiothreitol (DTT)Thermo ScientificR0862
Dnase/Rnase Free Distilled WaterAmbionAM9930
dNTPsThermo ScientificR0192
E. coli BL21(DE3) competent cellsInvitrogenC600003
EDTAFisher ScientificBP120-1
Elution BufferQiagen19086
ESF 921 insect cell culture medium (Insect cells media)Expression Systems96-001-01
FBS SolutionGibcoA38400-01
Fugene (transfection reagent)PromegaE2311
GentamicinFisher Scientific15750060
GlycerolSigma AldrichG5516-500
IGEPAL CA-630Sigma AldrichI8896-100ml
ImidazoleSigma Aldrich56750-1Kg
Influenza A (H1N1) synthetic RNATwist Bioscience103001
Influenza A (H3N2)  synthetic RNATwist Bioscience103002
Influenza B synthetic RNATwist Bioscience103003
IPTGGold BiotechnologyI3481C100
KanamycinGibco11815-032
LB AgarFisher ScientificBP1425-500
LB Broth mediaFisher ScientificBP1426-500
LysozymeSigma AldrichL6876-10G
Magnesium ChlorideSigma Aldrich13152-1Kg
MERS-CoV synthetic RNATwist Bioscience103015
MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction plates with Barcode (0.1 mL)Applied Biosystems10310855
Mini- PROTEAN TGX Precast GelBio-Rad456-1093
Miniprep kitQiagen27106
Ni-NTA Excel (HisTrap Excel) 5 mLCytiva17-3712-06
Ni-NTA HP (HisTrap HP) 5 mLCytiva17-5248-02
Optical Adhesice Covers (PCR Compatible,DNA/Rnase/PCR Inhibitors FreeApplied Biosystems4311971
Potassium ChlorideFisher BioreagentsBP366-1
Primers and ProbesIntegrated DNA Technologies, Inc.
Protease Inhibitor Mini tablets EDTA-FreeThermo ScientificA32955
Protein markerFermentas26616
RT-qPCR machine (QuantStudio 7 Flex)Applied Biosystems
S.O.C mediumFisher Scientific15544034
SARS-CoV-+A2:C442 synthetic RNATwist Bioscience102024
Sf9 insect cellsGibcoA35243
Sodium ChlorideSigma AldrichS3014-1Kg
StrepTrap XT 5 mLCytiva29401323
TetracyclineIBI ScientificIB02200
Tris Base Molecular Biology GradePromegaH5135
Tris-HClAffymetrix22676
Tween 20Sigma AldrichP1379-100ml
X-GalInvitrogenB1690

References

  1. Hu, B., Guo, H., Zhou, P., Shi, Z. L. Characteristics of SARS-CoV-2 and COVID-19. Nat Rev Microbiol. 19 (3), 141-154 (2021).
  2. Zhu, N., et al. A novel Coronavirus from patients with Pneumonia in China, 2019. N Eng....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE201TaqMMLV RTCOVID 19SARS CoV 2A BMERS CoV

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved