חקר התחלת מוות תאי באמצעות מיקרוסקופ דיגיטלי

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול לחקר קצב התחלת מוות תאי מתוכנת על ידי הדמיה רציפה של עלים מחוסנים לאחר השראת מוות תאי.

Abstract

תגובת רגישות יתר (HR) היא תגובת הגנה יעילה שניתן לקבוע על ידי הגנים של עמידות N . HR מתבטא בהיווצרות אזורי מוות של תאים על עלים מחוסנים. כאן מוצג פרוטוקול לחקר קצב התחלת המוות התאי על ידי הדמיית עלים מחוסנים בזמן שבין התחלת המוות התאי לבין הופעת המוות התאי באמצעות מיקרוסקופ דיגיטלי. המיקרוסקופ הדיגיטלי מאפשר תהליך הדמיה רציף בפרקי זמן רצויים, המאפשר קביעה מדויקת של קצב התחלת מוות תאי עד דקות בדיוק, בניגוד לשעות בשיטות מסורתיות. גם הדמיה במיקרוסקופ דיגיטלי אינה תלויה באור ולכן ניתן להשתמש בה ביום ובלילה מבלי להפריע לשעון הביולוגי של הצמח. ניתן לחקור פתו-מערכות שונות הגורמות להתפתחות מוות תאי מתוכנת באמצעות פרוטוקול זה עם שינויים קלים. בסך הכל, הפרוטוקול מאפשר זיהוי פשוט, מדויק וזול של שיעור התחלת מוות תאי.

Introduction

תפוח אדמה הוא אחד מגידולי המזון הנפוצים ביותר בעולם, מקום רביעי אחרי אורז, חיטה ותירס. עם זאת, ייצור תפוחי אדמה יכול להיות מושפע קשות על ידי וירוס תפוחי אדמה Y (PVY), אשר נחשב כיום פתוגן הנגיף החשוב ביותר שלה ^1,2. בצמחי תפוחי אדמה cv. Rywal, מספר זנים של PVY (כולל זן PVY N-Wilga) מעוררים תגובה רגישה (HR) - התנגדות המוענקת, כאשר הגבלת הפתוגן לאתר הזיהום מתבטאת בנגעים נמקיים על עלים מחוסנים³. בפתומערכת זו, HR מתווך על ידי גן עמידות Ny-1, שהוא תלוי טמפרטורה, שכן צמחים הגדלים בטמפרטורות נמוכות יותר מפתחים ביעילות נגעים נמקיים, ואילו בצמחים הגדלים באופן קונסטיטוטיבי בטמפרטורה גבוהה (28 מעלות צלזיוס), הפלה של עמידות מודגמת כחוסר היווצרות נגעים והתפשטות וירוס מערכתית ^3,4. כאשר הצמחים מועברים לטמפרטורה נמוכה יותר (22 מעלות צלזיוס), מתחיל מוות תאי, אשר יכול להיות מנוצל כדי לעקוב אחר קצב התחלת המוות התא על ידי הדמיה של עלים מחוסנים בזמן שבין התחלת המוות התא לבין הופעת המוות התאי.

פרוטוקול זה מדגים שיטה פשוטה לקביעת קצב התחלת מוות תאי באמצעות מיקרוסקופ דיגיטלי. על ידי הדמיה של העלים המחוסנים לאחר העברת הצמח מ-28 מעלות צלזיוס ל-22 מעלות צלזיוס, מיקרוסקופ דיגיטלי מאפשר תצפית רציפה על העלה בפרקי זמן רצויים. בניגוד לשימוש בשיטות אחרות (למשל, מיקרוסקופ קונפוקלי או תצפית על היווצרות נגעים בעין בלתי), הדבר מאפשר לקבוע את הזמן המדויק של היווצרות הנגע ולכן קצב התחלת המוות התאי עד דקות בדיוק, בניגוד לשעות בשיטות הנ"ל ^5,6. גם השימוש במיקרוסקופ דיגיטלי אינו תלוי באור ולכן ניתן להשתמש בו ביום ובלילה. פרוטוקול זה יכול לשמש גם לזיהוי רכיבים המעורבים בהתחלת מוות תאי או כדי לקבוע את ההשפעות של רכיבים שונים על קצב התחלת מוות תאי אם צמחים משומשים הם טרנסגניים ויש להם רמות שונות של רכיבים מעניינים.

Protocol

הערה: סעיפים 1 ו-2 מתארים פרוטוקול שונה להכנת חומר צמחי בהתבסס על השיטות שתוארו על ידי Lukan et ^al.7. באופן ספציפי, נעשו כמה שינויים בתנאים סביבתיים מבוקרים והכנת חיסונים.

1. גידול צמחי תפוחי אדמה

1. לגדל קורות חיים בריאים של תפוחי אדמה. צמחי ריוול בתרבית רקמת צומת גזע⁸.
2. לאחר 6-8 שבועות, חותכים עשרה חצילים באורך 1 ס"מ המכילים צמתים מצמחי תפוחי אדמה על נייר סטרילי בתנאים סטריליים באמצעות פינצטה סטרילית וסכין אזמל.
3. העבירו אותם לקופסאות פלסטיק עם מדיום Murashige ו-Skoog (MS30) (איור 1A) וגידלו אותם בתנאים סביבתיים מבוקרים (22°C באור ו-19°C בחושך עם קרינה של 250 μE או μmol/m/m 2/s ופוטופריוד של 16 שעות, בלחות יחסית^של 55% ±-5%).
4. מעבירים אותם לאדמה שבועיים לאחר מיקרו-ריבוי.
   1. ממלאים את העציצים (r = 10 ס"מ) באדמה. בעזרת אצבע יוצרים חור באדמה בעומק 3-4 ס"מ באמצע עציץ, ממלאים את החור במים ומחכים שהוא ייספג.
   2. הכניסו צמח אחד לכל עציץ לתוך החור, והשאירו את העלים מעל פני השטח. כסו בעדינות את השורשים באדמה (איור 1B).
      הערה: ייתכן שצמחים מסוימים לא יפתחו שורשים. להוציא צמחים אלה מן הניתוח.
5. לגדל את הצמחים באדמה בתא גידול בתנאים סביבתיים מבוקרים (22°C באור ו-19°C בחושך, בלחות יחסית של 55% ±-5%, עם קרינה של 250 μmol/m²/s ו-16 שעות).
6. לאחר 3-4 שבועות, הצמחים מוכנים. השתמשו בצמחים אלה כדי להתחסן.
   הערה: לצמחים צריכים להיות לפחות 3-4 עלים מפותחים לחלוטין עם עלעלים גלויים (איור 1C). הם צריכים להיראות בריאים, ללא תסמינים נראים לעין (עלים צהובים או חומים), אשר יכול להיות בטעות נגעים הנגרמים על ידי PVY. כדי להשיג תוצאות דומות, צמחים צריכים להיות מחוסנים באותו זמן (למשל, בשעה 9 בבוקר) בכל הניסויים כדי למנוע השפעות אפשריות של שעון ביולוגי על התגובה החיסונית של הצמח והיווצרות נגעים 9,10,11.

2. הכנת אינוקולום וחיסון תפוחי אדמה

1. יש לחסן את הצמח בזן PVY N-Wilga (PVY^N-Wi; מס' הצטרפות. EF558545) חיסון כאמור להלן.
   הערה: ניתן לחסן יותר צמחים במקביל אם קיים יותר ממיקרוסקופ דיגיטלי אחד. לצמחים צריכים להיות לפחות שלושה עלים מפותחים לחלוטין לפני החיסון (איור 1C). PVY^N-Wi מוכפל ומתוחזק בקורות חיים של תפוחי אדמה.
   1. הכן מאגר פוספט, בתוספת נתרן diethyldithiocarbamate (DIECA), לחיסון: לערבב 1.3 מ"ל של 0.2 M NaH 2 PO 4, 8.7 מ"ל של0.2 M Na₂HPO₄, ו 0.225 גרם של DIECA. לפצות את עוצמת הקול ל 100 מ"ל באמצעות ddH₂0. התאם את ה- pH ל- 7.6 על ידי הוספת תמיסת 1 M NaOH או 1 M HCl.
   2. קציר 6-8 שבועות PVY^N-Wi נגוע תפוח אדמה CV. צמחי פנטלנד מתרבית רקמה בשקיות מיצוי עם רשת פילטר (0.5 גרם ל-6 צמחים) ומוסיפים חיץ פוספט בתוספת DIECA (מסה פי 4 של חומר צמחי, מסה: יחס נפח). השתמש הומוגנייזר יד במשך 1-2 דקות כדי לקבל פתרון הומוגני.
   3. אבק קלות את שלושת העלים הראשונים המפותחים במלואם של צמחי תפוחי אדמה בני 3-4 שבועות (משלב 1.6) עם אבקת קרבורונדום.
      הערה: התאם את כמות אבקת קרבורונדום. יותר מדי עלול לגרום נזק, בעוד מעט מדי עלול לגרום לזיהום לא יעיל. באופן אופטימלי, 0.1 מ"ג / ס"מ של אבקת carborundum משמש, שהם כ 1.5 מ"ג של אבקה לכל עלה בגודל ממוצע (כ 15 ס"מ²).
   4. שפשפו בעדינות את העלים עם האינקולום (~ 100 מיקרוליטר לעלה). לאחר 10 דקות, לשטוף היטב את העלים עם מי ברז.
      1. היזהרו לא לפגוע בעלים. אין לחרוג מזמן הדגירה. יש להתאים את כמות החיסון בהתאם לגודל העלה - 6.5 מיקרוליטר/ס"מ, שהם כ-100 מיקרוליטר לעלה בגודל ממוצע (כ-15 ס"מ²).
   5. מעבירים את הצמחים לתא גידול ומגדלים אותם בתנאים סביבתיים מבוקרים (28°C באור ו-28°C בחושך בלחות יחסית של 55% ±-5%, עם קרינה של 250 μmol/m²/s ו-16 שעות פוטו-תקופה) למשך 3 ימים.

3. הכנת הצמח ושימוש במיקרוסקופ דיגיטלי לרישום התפתחות נגעים

1. העבר את הצמחים המחוסנים מתא הגידול הנשמר ב 28 ° C לתא גידול ב 22 ° C 3 ימים לאחר החיסון, עם תנאים אחרים כמתואר בשלב 1.5.
2. בחר צמח לתצפית. יש לשתק את העלה המחוסן השני באמצעות סרט הדבקה (איור 1D). ודאו שהעלה הרצוי משותק לחלוטין לפני תחילת ההדמיה (איור 1D).
3. התקן יישום תוכנה ללכידת תמונה במחשב הנייד. חבר את המיקרוסקופ הדיגיטלי למחשב. פתח את התוכנה.
   הערה: ודא שהמפעל, המיקרוסקופ הדיגיטלי והמחשב הנייד ממוקמים על המדף ליד השקע כדי לחבר את המחשב. ההחלטה על בחירת העלים לניטור עשויה להיות תלויה בשאלה הביולוגית הנחקרת, למשל, סוג התהליך המוביל להיווצרות מוות תאי מתוכנת מוגבל.
4. כוונן את המיקרוסקופ מעל העלה המשותק. התמקדו באמצעות החוגה במיקרוסקופ הדיגיטלי (מוצג באיור 1E).
   1. ודא כי קו הראייה רחב ככל האפשר כדי להגדיל את הסיכויים ללכוד את היווצרות הנגע אך עדיין מוגדל מספיק כדי לזהות את המראה של הנגע (בדרך כלל, הגדלה פי 25 משמש).
5. הגדר את הגדרות המצלמה. לחצו על כפתור ההגדרות בפינה השמאלית העליונה של התמונה (איור 2A, חלק 1 בעיגול) וכווננו את הגדרות המצלמה: בהירות (60-70), ניגודיות (10-15), גוון (0), איזון לבן, רוויה (45-50), חדות (0), גמא (5) (איור 2B). ההגדרות ששימשו במחקר זה היו כדלקמן: בהירות (64), ניגודיות (14), גוון (0), רוויה (47), חדות (0), גמא (5).
   הערה: יש לכוונן את הגדרות המצלמה לאור חיצוני כדי להבטיח את איכות התמונה הטובה ביותר. ניתן להתאים את ההגדרות בהתאם לתנאי המשתמש בתא הגידול.
6. קבעו את הגדרות לכידת התמונה על-ידי לחיצה על הסמל של Image Capture (איור 2C, בעיגול חלק 2). לחצו על כפתור הווידאו בהילוך מהיר והגדירו לכידת תמונה כל 15 דקות למשך 24 שעות (איור 2C).
   הערה: המרווח בין התמונות שצולמו לבין משך ההדמיה גמיש לחלוטין וניתן להתאים אותו בהתאם לצרכי הניסוי. בזמן שבין לכידת התמונה, נורית ה-LED כבויה. נורית ה-LED נדלקת באופן אוטומטי במהלך צילום תמונה.
7. התחל ללכוד תמונות על-ידי לחיצה על לחצן התחל (איור 2C).
   הערה: לאחר העברתם מ 28 ° C ל 22 ° C, צמחים צריכים להתחיל לפתח נגעים בתוך 24 שעות. אם לא, זה יכול להיות סימן לחיסון לא יעיל. התאימו את כמות אבקת הקרבורונדום, ודאו שזמן הדגירה של החיסון על העלים היה נכון, וקבעו את שפע הנגיף בחיסון על ידי qPCR.
8. לשמירת תמונות, בחרו בכל התמונות ולחצו על סמל השמירה (איור 2B, בעיגול חלק 3). הגדר אפשרויות ייצוא. הגדר DPI לכל היותר (300) (איור 2D). לאחר השמירה, מחק את כל התמונות בתוכנית.
9. עבור ניתוח תמונה, כל תוכנית לצפייה/עריכה של תמונות מספיקה. השימוש בתוכנה חופשית לעריכת תמונות, ImageJ, מוסבר להלן.
   1. ייבא את רצף הזמן של תמונות משדה ראייה יחיד (בפינה השמאלית העליונה, לחץ על קובץ, בחר ייבוא ולאחר מכן רצף תמונות). הדבק את הנתיב של ספריית התמונות שנשמרו ולחץ על בסדר כפתור כדי להתחיל את ההמרה.
   2. לאחר ההמרה, התוכנה פותחת באופן אוטומטי נגן וידאו פנימי המציג את הווידאו הסופי. ייצא את קובץ הווידאו על ידי לחיצה על קובץ > שמור כ אפשרות ובחירה בפורמט AVI. חלון קטן נפתח. הגדר את קצב מסגרות כ- 0.3 fps ולחץ על אישור כדי לשמור את הווידאו כקובץ וידאו AVI.
      הערה: ניתן לקבוע את זמן התפתחות הנגע גם על ידי בדיקה ידנית של כל התמונות ומציאת תמונה שבה הנגע מופיע.

Discussion

הפרוטוקול שהודגם מאפשר למשתמש לקבוע במדויק את קצב התחלת המוות התאי על ידי הדמיה רציפה של עלים מחוסנים בזמן שבין התחלת המוות התא לבין הופעת המוות התאי באמצעות מיקרוסקופ דיגיטלי. למרות שישנן דרכים רבות לניטור התרחשות נגעים ומחלות צמחים^12,13,14,15, פרוטוקול זה מציג את היתרון של מדידה שאינה תלויה באור מבלי להפריע לשעון הביולוגי של הצמח^, מכיוון שהאור כבוי בין מדידות.

לאחר החיסון, צמחים צריכים לגדול ב 28 °C (78 °F) במשך 3 ימים. גן עמידות Ny-1 , המשרה תגובה רגישה, תלוי טמפרטורה, ובצמחים הגדלים בטמפרטורות גבוהות יותר, מוביל להפלה של עמידות, המתבטאת בחוסר היווצרות נגעים והתפשטות וירוס מערכתית³. לאחר העברת צמחים ל -22 מעלות צלזיוס, מוות תאי מתחיל, ולכן לקבלת תוצאות מדויקות, תצפית במיקרוסקופ דיגיטלי צריכה להתחיל בהקדם האפשרי לאחר העברה זו. שלב מכריע נוסף בהכנת הצמח לדימות הוא אימוביליזציה של העלה (איור 1D), מאחר שהצמח ימשיך לגדול במהלך ההדמיה, מה שעלול להוציא את העלה הנצפה ממיקוד, או שמיקום כזה לא ייתן את התוצאות הרצויות.

אם הפרוטוקול המתואר משמש על צמחים טרנסגניים עם מרכיבים שונים של עניין, משוער להיות מעורב בהתחלת מוות תאי, הפרוטוקול מאפשר למשתמש לקבוע אם הרמה הנמוכה של רכיב נחקר משפיעה על קצב התחלת מוות תאי. על ידי כך, ניתן לזהות רכיבים המעורבים בהתחלת מוות תאי בפתו-מערכות, שבהן מתרחש מוות תאי מתוכנת, באמצעות פרוטוקול זה. שיטות אחרות לזיהוי רכיבים אלה הן, למשל, ניתוח שעתוק כגון RNA-seq או צורות שונות של מיקרוסקופיה, אשר יכול להיות יקר זמן^{רב 16}. השיטה המתוארת בפרוטוקול זה מאפשרת זיהוי קל וזול של רכיבים המעורבים בהתחלת מוות תאי על ידי התבוננות בהבדלים בשיעורי התחלת מוות תאי בין צמחים טרנסגניים לצמחי ביקורת. באופן אופטימלי, במערך כזה, יש להשתמש בשתי מצלמות דיגיטליות, שכן יש לנתח צמח מהונדס במקביל למפעל בקרה באותו ניסוי.

בפרוטוקול זה נעשה שימוש בזן PVY N-Wilga; עם זאת, זנים אחרים של וירוס זה, למשל, GFP מתויג PVY (PVY-N605(123)-GFP)⁷, יכול לשמש גם. יתר על כן, פתו-מערכות אחרות, הגורמות להתפתחות מוות תאי מתוכנת, יכולות להיחקר באמצעות פרוטוקול זה עם שינויים קלים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alcohol burner	Mikro+Polo	SH-234002455	For tweezers and scalpel sterilization
Autoclave A-21 CAV	Kambi	N/A
Bacto Agar	Becton, Dickinson and Company	214010
Carborundum powder	VWR Chemicals	22505297
DinoCapture 2.0	Dino-Lite	Version 2.0	software for digital microscope
Dino-Lite Edge AM7915MZTL digital microscope	AnMo Electronics Corporation	AM7915MZTL
Ethanol, 70%	Stella Tech	P94000	For tweezers and scalpel sterilization
Extraction bags	Bioreba	420100
Growth chamber FS-WI	Photon Systems Insturments	N/A
Hand homogenizer	Bioreba	400010
Hawita Special Substrate	HAWITA Gruppe	2000000071701	Ready to use substrate, made using peat (H4-H6 and H6-H8)
Hydrochloric acid (HCl)	Merck	109057
Label tape	Sigma	L8144-5EA
Laptop computer with installed DinoCapture 2.0	HP	Z2V77EA#BED	Computer needs to be transferable as experiment takes part in a growth chamber
Murashige and Skoog medium	Duchefa Biochemie	M02220100
Na2HPO4	Emsure	1065860500
NaH2PO4	Emsure	1064700250
Pasteur pipette  0.5 mL	Brand	21500209
pH-meter	Mettler Toledo	ML1601
Plastic boxes	Cvetlice Dornig	VCG10.5	Radius = 10.5 cm
Plastic pots	Lab Associates	DIS40003	Radius = 11.5 cm (top), Radius = 9.8 cm (bottom)
Saccharose	Kemika d.d.	1800408
Sodium Diethyldithiocarbamate (DIECA)	Sigma-Aldeich	228680	Sodium diethyldithiocarbamate trihydrate, ACS reagent
Sodium hydroxide (NaOH)	Merck	106462
Sterile surgical blades	Braun	4511733633
Tweezers	Braun	BD033R