Estudando a iniciação da morte celular usando um microscópio digital

Summary

Aqui apresentamos um protocolo para estudar a taxa de iniciação de morte celular programada por imagens contínuas de folhas inoculadas após indução de morte celular.

Abstract

A resistência conferida pela resposta hipersensível (HR) é uma resposta de defesa efetiva que pode ser determinada pelos genes de resistência ao N . A HR manifesta-se como a formação de zonas de morte celular nas folhas inoculadas. Aqui, um protocolo para estudar a taxa de iniciação da morte celular por imagem de folhas inoculadas no tempo entre o início da morte celular e o aparecimento da morte celular usando um microscópio digital é apresentado. O microscópio digital permite um processo contínuo de aquisição de imagens em intervalos desejados, o que permite uma determinação precisa da taxa de iniciação de morte celular em até minutos exatamente, ao contrário de horas nos métodos tradicionais. A imagem com o microscópio digital também é independente da luz e, portanto, pode ser usada durante o dia e a noite sem perturbar o ritmo circadiano da planta. Diferentes patossistemas que resultam no desenvolvimento de morte celular programada podem ser estudados usando este protocolo com pequenas modificações. De modo geral, o protocolo permite, portanto, a identificação simples, precisa e barata da taxa de iniciação de morte celular.

Introduction

A batata é uma das culturas alimentares mais cultivadas do mundo, em quarto lugar, atrás do arroz, trigo e milho. No entanto, a produção de batata pode ser severamente afetada pelo vírus Y da batata (PVY), que atualmente é considerado seu patógeno viral mais importante ^1,2. Em plantas de batata cv. Rywal, várias cepas de PVY (incluindo a cepa PVY N-Wilga) desencadeiam resistência conferida por resposta de hipersensibilidade (HR), onde a restrição do patógeno ao local da infecção se manifesta como lesões necróticas nas folhas inoculadas³. Nesse patossistema, a HR é mediada pelo gene de resistência Ny-1, que é dependente da temperatura, uma vez que plantas cultivadas em temperaturas mais baixas desenvolvem eficientemente lesões necróticas, enquanto em plantas cultivadas constitutivamente em temperatura elevada (28 °C), o aborto de resistência é demonstrado como ausência de formação de lesões e disseminação sistêmica do vírus ^3,4. Quando as plantas são transferidas para uma temperatura mais baixa (22 °C), inicia-se a morte celular, que pode ser explorada para acompanhar a taxa de início da morte celular por imagem das folhas inoculadas no tempo entre o início da morte celular e o aparecimento da morte celular.

Este protocolo demonstra um método simples para a determinação da taxa de iniciação de morte celular usando um microscópio digital. Através da obtenção de imagens das folhas inoculadas após a transferência da planta de 28 °C para 22 °C, um microscópio digital permite a observação contínua da folha em intervalos desejados. Diferentemente do uso de outros métodos (por exemplo, microscopia confocal ou observação da formação da lesão a olho nu), este permite determinar o tempo exato de formação da lesão e, portanto, a taxa de iniciação da morte celular até minutos exatamente, ao contrário das horas^{nos métodos citados 5,6}. O uso do microscópio digital também é independente da luz e, portanto, pode ser usado durante o dia e a noite. Este protocolo também pode ser usado para identificar componentes envolvidos no início da morte celular ou para determinar os efeitos de diferentes componentes na taxa de iniciação da morte celular se as plantas usadas forem transgênicas e tiverem níveis alterados de componentes de interesse.

Protocol

NOTA: As seções 1 e 2 descrevem um protocolo modificado para preparação de material vegetal baseado nos métodos descritos por Lukan et ^al.7. Especificamente, algumas modificações nas condições ambientais controladas e no preparo do inóculo foram feitas.

1. Cultivo de plantas de batata

1. Cultivar batata saudável cv. Plantas de Rywal em cultura de tecido de nós caulinares⁸.
2. Após 6-8 semanas, cortar dez explantes de 1 cm de comprimento contendo nós de plantas de batata em papel estéril em condições estéreis usando pinças estéreis e uma faca de bisturi.
3. Transferi-los para caixas plásticas com meio Murashige e Skoog (MS30) (Figura 1A) e cultivá-los em condições ambientais controladas (22 °C no claro e 19 °C no escuro com radiação de 250 μE ou μmol/m²/s e fotoperíodo de 16 h, com umidade relativa de 55% ± 5%).
4. Transfira-os para o solo 2 semanas após a micropropagação.
   1. Encha os vasos (r = 10 cm) com terra. Use um dedo para criar um buraco de 3 a 4 cm de profundidade no solo no meio de um vaso, encha o buraco com água e espere que ele absorva.
   2. Coloque uma planta por vaso no buraco, deixando as folhas acima da superfície. Cubra suavemente as raízes com terra (Figura 1B).
      NOTA: Algumas plantas podem não desenvolver raízes. Exclua essas plantas da análise.
5. Cultivar as plantas no solo em câmara de crescimento sob condições ambientais controladas (22 °C na luz e 19 °C no escuro, com umidade relativa de 55% ± 5%, com radiação de²⁵⁰ μmol/m 2/s e fotoperíodo de 16 h).
6. Após 3-4 semanas, as plantas estão prontas. Use essas plantas para serem inoculadas.
   NOTA: As plantas devem ter pelo menos 3-4 folhas totalmente desenvolvidas com folíolos visíveis (Figura 1C). Eles devem parecer saudáveis, sem sintomas visíveis (folhas amarelas ou marrons), o que pode ser confundido com lesões causadas por PVY. Para obter resultados comparáveis, as plantas devem ser inoculadas ao mesmo tempo (por exemplo, às 9 horas) em todos os experimentos para evitar possíveis efeitos do ritmo circadiano sobre a resposta imune das plantas e a formação de lesões 9,10,11.

2. Preparo do inóculo e inoculação da batata

1. Inocular a planta com a cepa PVY N-Wilga (PVY^N-Wi; acesso nº. EF558545) inóculo conforme indicado a seguir.
   NOTA: Mais plantas podem ser inoculadas em paralelo se mais de um microscópio digital estiver disponível. As plantas devem ter pelo menos três folhas completamente desenvolvidas antes da inoculação (Figura 1C). PVY^N-Wi é multiplicado e mantido em batata cv.
   1. Preparar tampão fosfato, suplementado com dietilditiocarbamato de sódio (DIECA), para inoculação: Misturar 1,3 mL de 0,2 M NaH 2 PO 4,8,7 mL de 0,2 M Na₂HPO₄ e 0,225 g de DIECA. Completar o volume para 100 mL usando ddH₂0. Ajustar o pH para 7,6 adicionando solução de NaOH 1 M ou HCl 1 M.
   2. Colheita de batata^{infectada PVY N-Wi com 6-8} semanas de idade. Plantas de Pentland de cultura de tecidos em sacos de extração com rede filtrante (0,5 g por 6 plantas) e adicionar tampão fosfato suplementado com DIECA (4x massa de material vegetal, relação massa:volume). Use um homogeneizador manual por 1-2 min para obter uma solução homogênea.
   3. Polvilhe levemente as três primeiras folhas de fundo totalmente desenvolvidas de plantas de batata com 3-4 semanas de idade (a partir do passo 1.6) com pó de carborundum.
      NOTA: Ajuste a quantidade de carborundum em pó. Muito pode causar danos, enquanto muito pouco pode resultar em infecção ineficaz. Idealmente, utiliza-se 0,1 mg/cm de pó de carborundum, que é aproximadamente 1,5 mg de pó por folha de tamanho médio (aproximadamente 15 cm²).
   4. Esfregue suavemente as folhas com o inóculo (~100 μL por folha). Após 10 min, lave bem as folhas com água da torneira.
      1. Cuidado para não prejudicar as folhas. Não exceda o tempo de incubação. Ajustar a quantidade de inóculo de acordo com o tamanho da folha - 6,5 μL/cm, que é de aproximadamente 100 μL por folha de tamanho médio (aproximadamente 15 cm²).
   5. Transferir as plantas para uma câmara de crescimento e cultivá-las em condições ambientais controladas (28 °C no claro e 28 °C no escuro a uma umidade relativa de 55% ± 5%, com radiação de 250 μmol/m²/s e fotoperíodo de 16 h) por 3 dias.

3. Preparo das plantas e uso do microscópio digital para registro do desenvolvimento da lesão

1. Transferir as plantas inoculadas da câmara de crescimento mantida a 28 °C para uma câmara de crescimento a 22 °C 3 dias após a inoculação, com outras condições descritas na etapa 1.5.
2. Selecione uma planta para observação. Imobilizar a segunda folha inoculada com fita adesiva (Figura 1D). Certifique-se de que a folha desejada esteja totalmente imobilizada antes de iniciar a aquisição de imagens (Figura 1D).
3. Instale um aplicativo de software para captura de imagens no laptop. Conecte o microscópio digital ao computador. Abra o software.
   NOTA: Certifique-se de que a planta, o microscópio digital e o portátil estão posicionados na prateleira perto da tomada para ligar o computador. A decisão sobre a seleção das folhas a serem monitoradas pode depender da questão biológica estudada, por exemplo, do tipo de processo que leva à formação de morte celular programada limitada.
4. Ajustar o microscópio acima da folha imobilizada. Focalizar usando o mostrador no microscópio digital (mostrado na Figura 1E).
   1. Certifique-se de que a linha de visão seja a mais larga possível para aumentar as chances de capturar a formação da lesão, mas ainda ampliada o suficiente para detectar a aparência da lesão (normalmente, o aumento de 25x é usado).
5. Defina as configurações da câmera. Clique no botão Configurações no canto superior direito da imagem (Figura 2A, parte 1 circulada) e ajuste as configurações da câmera: Brilho (60-70), Contraste (10-15), Matiz (0), Balanço de Branco, Saturação (45-50), Nitidez (0), Gama (5) (Figura 2B). As configurações utilizadas neste estudo foram: Brilho (64), Contraste (14), Matiz (0), Saturação (47), Nitidez (0), Gama (5).
   NOTA: As configurações da câmera devem ser ajustadas à luz externa para garantir a melhor qualidade de imagem. As configurações podem ser adaptadas de acordo com as condições do usuário na câmara de crescimento.
6. Defina as configurações de captura de imagem clicando no ícone para Captura de imagem (Figura 2C, parte 2 circulada). Clique no botão Time-Lapsed Video e defina Image Capture a cada 15 min por 24 h (Figura 2C).
   NOTA: O intervalo entre as imagens obtidas e a duração das imagens é totalmente flexível e pode ser adaptado de acordo com as necessidades do experimento. No tempo entre a captura da imagem, a luz LED é apagada. A luz LED é automaticamente acesa durante a captura da imagem.
7. Inicie a captura de imagem clicando no botão START (Figura 2C).
   NOTA: Após serem transferidas de 28 °C para 22 °C, as plantas devem começar a desenvolver lesões dentro de 24 h. Caso contrário, isso pode ser um sinal de inoculação ineficaz. Ajustar a quantidade de pó de carborundum, certificar-se de que o tempo de incubação do inóculo nas folhas foi correto e determinar a abundância de vírus no inóculo por qPCR.
8. Para salvar imagens, selecione todas as imagens e clique no ícone Salvar (Figura 2B, parte 3 circulada). Defina Opções de exportação. Defina o DPI no máximo (300) (Figura 2D). Depois de salvar, exclua todas as imagens no programa.
9. Para análise de imagens, qualquer programa para visualização/edição de imagens é suficiente. O uso de software livre para edição de imagens, ImageJ, é explicado abaixo.
   1. Importe a sequência temporal de imagens de um único campo de visão (no canto superior esquerdo, clique em Arquivo, selecione Importar e Sequência de Imagens). Cole o caminho do diretório de imagens salvas e pressione o botão OK para iniciar a conversão.
   2. Após a conversão, o software abre automaticamente um player de vídeo interno mostrando o vídeo final. Exporte o arquivo de vídeo clicando na opção Arquivo > Salvar como e selecionando Formato AVI. Uma pequena janela se abre. Defina a taxa de quadros como 0,3 fps e pressione OK para salvar o vídeo como um arquivo de vídeo AVI.
      NOTA: O tempo de desenvolvimento da lesão também pode ser determinado verificando manualmente todas as imagens e encontrando uma imagem onde a lesão aparece.

Discussion

O protocolo demonstrado permite que o usuário determine com precisão a taxa de iniciação da morte celular por meio de imagens contínuas de folhas inoculadas no tempo entre o início da morte celular e o aparecimento da morte celular usando um microscópio digital. Embora existam inúmeras formas de monitorar a ocorrência de lesões e doenças de plantas12,13,14,15, esse protocolo apresenta a vantagem de medir sem perturbar o ritmo circadiano da planta^, uma vez que a luz é apagada entre as medidas.

Após a inoculação, as plantas devem crescer a 28 °C por 3 dias. O gene de resistência Ny-1 , que induz uma resposta de hipersensibilidade, é dependente da temperatura e, em plantas cultivadas em temperaturas mais elevadas, leva ao aborto da resistência, que se manifesta como falta de formação de lesões e disseminação sistêmica do vírus³. Depois que as plantas são transferidas para 22 °C, a morte celular é iniciada, portanto, para resultados precisos, a observação com um microscópio digital deve começar o mais rápido possível após essa transferência. Outro passo crucial no preparo da planta para a obtenção de imagens é a imobilização da folha (Figura 1D), pois a planta continuará a crescer durante a obtenção de imagens, o que pode tirar a folha observada do foco, ou tal configuração não dará os resultados desejados.

Se o protocolo descrito for usado em plantas transgênicas com componentes de interesse alterados, hipotetizados para estarem envolvidos no início da morte celular, o protocolo permite ao usuário determinar se o nível diminuído de um componente estudado afeta a taxa de iniciação da morte celular. Com isso, componentes envolvidos no início da morte celular podem ser identificados em patossistemas, onde ocorre morte celular programada, utilizando este protocolo. Outros métodos para identificar esses componentes são, por exemplo, a análise transcriptômica como RNA-seq ou várias formas de microscopia, que podem ser caras e^demoradas16. O método descrito neste protocolo permite a identificação fácil e barata dos componentes envolvidos no início da morte celular, observando diferenças nas taxas de iniciação de morte celular entre plantas transgênicas e controle. Idealmente, em tal configuração, duas câmeras digitais devem ser usadas, pois uma planta transgênica deve ser analisada em paralelo com uma planta controle dentro do mesmo experimento.

Nesse protocolo, utilizou-se a cepa PVY N-Wilga; no entanto, outras cepas desse vírus, por exemplo, PVY marcado com GFP (PVY-N605(123)-GFP)⁷, também poderiam ser usadas. Além disso, outros patossistemas, que resultam no desenvolvimento de morte celular programada, poderiam ser estudados usando este protocolo com pequenas modificações.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alcohol burner	Mikro+Polo	SH-234002455	For tweezers and scalpel sterilization
Autoclave A-21 CAV	Kambi	N/A
Bacto Agar	Becton, Dickinson and Company	214010
Carborundum powder	VWR Chemicals	22505297
DinoCapture 2.0	Dino-Lite	Version 2.0	software for digital microscope
Dino-Lite Edge AM7915MZTL digital microscope	AnMo Electronics Corporation	AM7915MZTL
Ethanol, 70%	Stella Tech	P94000	For tweezers and scalpel sterilization
Extraction bags	Bioreba	420100
Growth chamber FS-WI	Photon Systems Insturments	N/A
Hand homogenizer	Bioreba	400010
Hawita Special Substrate	HAWITA Gruppe	2000000071701	Ready to use substrate, made using peat (H4-H6 and H6-H8)
Hydrochloric acid (HCl)	Merck	109057
Label tape	Sigma	L8144-5EA
Laptop computer with installed DinoCapture 2.0	HP	Z2V77EA#BED	Computer needs to be transferable as experiment takes part in a growth chamber
Murashige and Skoog medium	Duchefa Biochemie	M02220100
Na2HPO4	Emsure	1065860500
NaH2PO4	Emsure	1064700250
Pasteur pipette  0.5 mL	Brand	21500209
pH-meter	Mettler Toledo	ML1601
Plastic boxes	Cvetlice Dornig	VCG10.5	Radius = 10.5 cm
Plastic pots	Lab Associates	DIS40003	Radius = 11.5 cm (top), Radius = 9.8 cm (bottom)
Saccharose	Kemika d.d.	1800408
Sodium Diethyldithiocarbamate (DIECA)	Sigma-Aldeich	228680	Sodium diethyldithiocarbamate trihydrate, ACS reagent
Sodium hydroxide (NaOH)	Merck	106462
Sterile surgical blades	Braun	4511733633
Tweezers	Braun	BD033R