Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להדמיית סידן ex vivo בדרוזופילה למבוגרים המבטאים GCaMP6 לניטור פעילויות אפילפטיפורמיות. הפרוטוקול מספק כלי רב ערך לחקר אירועים איקטליים בדרוזופילה בוגרת באמצעות הדמיית סידן ex vivo , המאפשר לחקור את המנגנונים הפוטנציאליים של אפילפסיה ברמה התאית.

Abstract

אפילפסיה היא הפרעה נוירולוגית המאופיינת בהתקפים חוזרים, בקורלציה חלקית עם מוצא גנטי, המשפיעה על יותר מ-70 מיליון אנשים ברחבי העולם. למרות החשיבות הקלינית של אפילפסיה, הניתוח התפקודי של הפעילות העצבית במערכת העצבים המרכזית עדיין צריך להתפתח. ההתקדמות האחרונה בטכנולוגיית ההדמיה, בשילוב עם ביטוי יציב של מדדי סידן מקודדים גנטית, כגון GCaMP6, חוללו מהפכה בחקר האפילפסיה הן ברמת המוח והן ברמת הרזולוציה של תא בודד. Drosophila melanogaster התפתחה ככלי לחקר המנגנונים המולקולריים והתאיים העומדים בבסיס אפילפסיה בשל הגנטיקה המולקולרית המתוחכמת שלה ומבחני ההתנהגות שלה. במחקר זה, אנו מציגים פרוטוקול חדשני ויעיל להדמיית סידן ex vivo בדרוזופילה למבוגרים המבטאים GCaMP6 לניטור פעילויות אפילפטיפורמיות. המוח כולו מוכן מקאק, גן אפילפסיה ידוע, זבובים להדמיית סידן במיקרוסקופ קונפוקלי כדי לזהות את הפעילות העצבית כהמשך לבדיקת התנהגות דמוית פרכוס. זבובי ה-cac הראו שיעור גבוה יותר של התנהגות דמוית התקפים ופעילויות סידן חריגות, כולל יותר קוצים גדולים ופחות קוצים קטנים מאשר זבובי בר. פעילויות הסידן היו בקורלציה להתנהגות דמוית התקף. מתודולוגיה זו משמשת כמתודולוגיה יעילה בסינון הגנים הפתוגניים לאפילפסיה ובחקר המנגנון הפוטנציאלי של אפילפסיה ברמה התאית.

Introduction

אפילפסיה, הפרעה נוירולוגית כרונית מורכבת המאופיינת בהישנות של התקפים ספונטניים וללא התגרות ופעילות חריגה ברשת העצבית, השפיעה על יותר מ -70 מיליון אנשים ברחבי העולם, מה שהופך אותה לאחת המחלות הנוירולוגיות הנפוצות ביותר1 ומוביל לנטל כבד של משפחות וחברה. בהתחשב בהשפעת האפילפסיה, נערכו מחקרים רבים לזיהוי האטיולוגיה של התקפים, אשר גנטיקה אושרה כגורם עיקרי לסוגים רבים של אפילפסיה או תסמונות אפילפטיות. בעשורים האחרונים, התקדמות בטכנולוגיות גנומיות הובילה לעלייה מהירה בגילוי גנים חדשים הקשורים לאפילפסיה, הממלאים תפקיד מכריע בהתרחשות פרכוסים, כולל תעלות יונים וגנים שאינם תעלות יונים 3,4

Protocol

1. פרוטוקול לבדיקה רגישה למפץ

  1. ביסוס זבובי הניסוי על ידי חציית קו הנהג tub-Gal4 עם קו UAS-cac-RNAi דרך מערכת Gal4/UAS21. אספו את הזבובים הבתוליים של קו אמבט-Gal4 ואת הזבובים הזכרים של קו UAS-cac-RNAi . לאחר מכן, העבירו את הזבובים הבתולים והזכרים לאותו בקבוקון כדי לקצו?.......

Representative Results

באמצעות פרוטוקול זה, מצאנו כי זבובי קאק הראו שיעורים גבוהים משמעותית של התנהגות דמוית התקף מאשר זבובי WT (17.00 ± 2.99 [n = 6] לעומת 4.50 ± 2.03 [n = 6]; P = 0.0061; מבחן t של תלמיד, איור 1A). רוב זבובי tub-Gal4>UAS-cac-RNAi התאוששו תוך 1-5 שניות, בעוד שזבובי UAS-cac-RNAi התאוששו תוך 2 שני.......

Discussion

יון הסידן משמש כשליח שני מכריע, וממלא תפקיד מרכזי במגוון תגובות פיזיולוגיות ופתופיזיולוגיות להפרעות כימיות וחשמליות כאחד. יתר על כן, היסוד הטופולוגי של ערוצי P/Q הפרה-סינפטיים, המקודדים על ידי הגן CACNA1A האדם, זוהה כאחראי לתיווך פריקה של מוליכים עצביים שונים, כולל גלוטמט 30,31,32

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי קרן המחקר הבסיסית והיישומית של גואנגדונג (מענק מס '2022A151111123 לג'ינג-דה קיאו) ותוכנית לשפר את המחקר המדעי ב- GMU (ג'ינג-דה קיאו). עבודה זו נתמכה גם על ידי תוכנית Enihancement Innovation Ability של האוניברסיטה הרפואית של גואנגזו (מימון מס '02-408-2304-02038XM).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
BrushesPaneraAAhc022-2for handling flies
Calcium chloride (CaCl2)Sigma-AldrichC4901
Confocal microscopeSP8; Zeiss, Jena, Germany.N/Afor calcium imaging
CO2 anesthesia machineN/AN/Afor Anesthetizing the flies.
C-sharp holderN/AN/Ahandmade, for mounting the brain
Culture vialsBiologix51-05002.5 cm diameter, 9.5 cm height
Fiji softwareNational Institutes of Health, Bethesda, MD, USAversion: 2.14.0for analysis
Fly morgueN/AN/Ahandmade, for handling flies
Fly stockscac-RNAi27244from Bloomington Drosophila Stock Center
Fly stocksGCaMP6m42750from Bloomington Drosophila Stock Center
Fly stockstub-Gal4N/Afrom the Sion-Frech Hoffmann Institute, Guangzhou Medical University
GlucoseSigma-AldrichG8270
High-resolution cameraN/AN/Afor recording the seizure-like behavior assay
L-lysineSigma-AldrichL5626
Magnesium chloride solution (MgCl2)Sigma-AldrichM1028
Papain suspensionWorthington BiochemicalLS003126
Petri dishesSigma-AldrichSLW1480/02Dfor dissection
PipetteThermo Scientific4640010, 4640030, 4640050, 4640060for transporting a measured volume of liquid and diseccected brain
Potassium chloride (KCl)Sigma-AldrichP4504
Recording dishThermo Scientific150682- Glass Based Dishfor holding the brain and calcium imaging
Sodium bicarbonate (NaHCO3)Sigma-AldrichS5761
Sodium chloride (NaCl)Sigma-AldrichS5886
Sodium hydroxide (NaOH)Fisher ScientificS25550
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)Sigma-AldrichS8282
Stereo-binocular microscopeSHANG GUANGXTZ-Dfor handling flies and dissection
Syringe needlespythonbioHCL0693for dissection
TripodWEIFENG45634732523for recording the seizure-like behavior assay
Vortex mixerLab dancer, IKA, Germany/Sigma-AldrichZ653438for performing the seizure-like behavior assay
WhiteboardN/AN/Ahandmade, foam pad or paper for background

References

  1. Thijs, R. D., Surges, R., O'brien, T. J., Sander, J. W. Epilepsy in adults. Lancet. 393 (10172), 689-701 (2019).
  2. Ellis, C. A., Petrovski, S., Berkovic, S. F. Epilepsy genetics: Clinical impacts and biological insights. Lancet Neurol. ....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Ex VivoGCaMP6Cac

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved