אקס ויוו הדמיית סידן למודל דרוזופילה לאפילפסיה

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להדמיית סידן ex vivo בדרוזופילה למבוגרים המבטאים GCaMP6 לניטור פעילויות אפילפטיפורמיות. הפרוטוקול מספק כלי רב ערך לחקר אירועים איקטליים בדרוזופילה בוגרת באמצעות הדמיית סידן ex vivo , המאפשר לחקור את המנגנונים הפוטנציאליים של אפילפסיה ברמה התאית.

Abstract

אפילפסיה היא הפרעה נוירולוגית המאופיינת בהתקפים חוזרים, בקורלציה חלקית עם מוצא גנטי, המשפיעה על יותר מ-70 מיליון אנשים ברחבי העולם. למרות החשיבות הקלינית של אפילפסיה, הניתוח התפקודי של הפעילות העצבית במערכת העצבים המרכזית עדיין צריך להתפתח. ההתקדמות האחרונה בטכנולוגיית ההדמיה, בשילוב עם ביטוי יציב של מדדי סידן מקודדים גנטית, כגון GCaMP6, חוללו מהפכה בחקר האפילפסיה הן ברמת המוח והן ברמת הרזולוציה של תא בודד. Drosophila melanogaster התפתחה ככלי לחקר המנגנונים המולקולריים והתאיים העומדים בבסיס אפילפסיה בשל הגנטיקה המולקולרית המתוחכמת שלה ומבחני ההתנהגות שלה. במחקר זה, אנו מציגים פרוטוקול חדשני ויעיל להדמיית סידן ex vivo בדרוזופילה למבוגרים המבטאים GCaMP6 לניטור פעילויות אפילפטיפורמיות. המוח כולו מוכן מקאק, גן אפילפסיה ידוע, זבובים להדמיית סידן במיקרוסקופ קונפוקלי כדי לזהות את הפעילות העצבית כהמשך לבדיקת התנהגות דמוית פרכוס. זבובי ה-cac הראו שיעור גבוה יותר של התנהגות דמוית התקפים ופעילויות סידן חריגות, כולל יותר קוצים גדולים ופחות קוצים קטנים מאשר זבובי בר. פעילויות הסידן היו בקורלציה להתנהגות דמוית התקף. מתודולוגיה זו משמשת כמתודולוגיה יעילה בסינון הגנים הפתוגניים לאפילפסיה ובחקר המנגנון הפוטנציאלי של אפילפסיה ברמה התאית.

Introduction

אפילפסיה, הפרעה נוירולוגית כרונית מורכבת המאופיינת בהישנות של התקפים ספונטניים וללא התגרות ופעילות חריגה ברשת העצבית, השפיעה על יותר מ -70 מיליון אנשים ברחבי העולם, מה שהופך אותה לאחת המחלות הנוירולוגיות הנפוצות ביותר¹ ומוביל לנטל כבד של משפחות וחברה. בהתחשב בהשפעת האפילפסיה, נערכו מחקרים רבים לזיהוי האטיולוגיה של התקפים, אשר גנטיקה אושרה כגורם עיקרי לסוגים רבים של אפילפסיה או תסמונות אפילפטיות^. בעשורים האחרונים, התקדמות בטכנולוגיות גנומיות הובילה לעלייה מהירה בגילוי גנים חדשים הקשורים לאפילפסיה, הממלאים תפקיד מכריע בהתרחשות פרכוסים, כולל תעלות יונים וגנים שאינם תעלות יונים ^3,4

Protocol

1. פרוטוקול לבדיקה רגישה למפץ

1. ביסוס זבובי הניסוי על ידי חציית קו הנהג tub-Gal4 עם קו UAS-cac-RNAi דרך מערכת Gal4/UAS²¹. אספו את הזבובים הבתוליים של קו אמבט-Gal4 ואת הזבובים הזכרים של קו UAS-cac-RNAi . לאחר מכן, העבירו את הזבובים הבתולים והזכרים לאותו בקבוקון כדי לקצו?.......

Discussion

יון הסידן משמש כשליח שני מכריע, וממלא תפקיד מרכזי במגוון תגובות פיזיולוגיות ופתופיזיולוגיות להפרעות כימיות וחשמליות כאחד. יתר על כן, היסוד הטופולוגי של ערוצי P/Q הפרה-סינפטיים, המקודדים על ידי הגן CACNA1A האדם, זוהה כאחראי לתיווך פריקה של מוליכים עצביים שונים, כולל גלוטמט 30,31,32

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Brushes	Panera	AAhc022-2	for handling flies
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C4901
Confocal microscope	SP8; Zeiss, Jena, Germany.	N/A	for calcium imaging
CO2 anesthesia machine	N/A	N/A	for Anesthetizing the flies.
C-sharp holder	N/A	N/A	handmade, for mounting the brain
Culture vials	Biologix	51-0500	2.5 cm diameter, 9.5 cm height
Fiji software	National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA	version: 2.14.0	for analysis
Fly morgue	N/A	N/A	handmade, for handling flies
Fly stocks	cac-RNAi	27244	from Bloomington Drosophila Stock Center
Fly stocks	GCaMP6m	42750	from Bloomington Drosophila Stock Center
Fly stocks	tub-Gal4	N/A	from the Sion-Frech Hoffmann Institute, Guangzhou Medical University
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
High-resolution camera	N/A	N/A	for recording the seizure-like behavior assay
L-lysine	Sigma-Aldrich	L5626
Magnesium chloride solution (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M1028
Papain suspension	Worthington Biochemical	LS003126
Petri dishes	Sigma-Aldrich	SLW1480/02D	for dissection
Pipette	Thermo Scientific	4640010, 4640030, 4640050, 4640060	for transporting a measured volume of liquid and diseccected brain
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P4504
Recording dish	Thermo Scientific	150682- Glass Based Dish	for holding the brain and calcium imaging
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S5761
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S5886
Sodium hydroxide (NaOH)	Fisher Scientific	S25550
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)	Sigma-Aldrich	S8282
Stereo-binocular microscope	SHANG GUANG	XTZ-D	for handling flies and dissection
Syringe needles	pythonbio	HCL0693	for dissection
Tripod	WEIFENG	45634732523	for recording the seizure-like behavior assay
Vortex mixer	Lab dancer, IKA, Germany/Sigma-Aldrich	Z653438	for performing the seizure-like behavior assay
Whiteboard	N/A	N/A	handmade, foam pad or paper for background