A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול להדמיית סידן ex vivo בדרוזופילה למבוגרים המבטאים GCaMP6 לניטור פעילויות אפילפטיפורמיות. הפרוטוקול מספק כלי רב ערך לחקר אירועים איקטליים בדרוזופילה בוגרת באמצעות הדמיית סידן ex vivo , המאפשר לחקור את המנגנונים הפוטנציאליים של אפילפסיה ברמה התאית.
אפילפסיה היא הפרעה נוירולוגית המאופיינת בהתקפים חוזרים, בקורלציה חלקית עם מוצא גנטי, המשפיעה על יותר מ-70 מיליון אנשים ברחבי העולם. למרות החשיבות הקלינית של אפילפסיה, הניתוח התפקודי של הפעילות העצבית במערכת העצבים המרכזית עדיין צריך להתפתח. ההתקדמות האחרונה בטכנולוגיית ההדמיה, בשילוב עם ביטוי יציב של מדדי סידן מקודדים גנטית, כגון GCaMP6, חוללו מהפכה בחקר האפילפסיה הן ברמת המוח והן ברמת הרזולוציה של תא בודד. Drosophila melanogaster התפתחה ככלי לחקר המנגנונים המולקולריים והתאיים העומדים בבסיס אפילפסיה בשל הגנטיקה המולקולרית המתוחכמת שלה ומבחני ההתנהגות שלה. במחקר זה, אנו מציגים פרוטוקול חדשני ויעיל להדמיית סידן ex vivo בדרוזופילה למבוגרים המבטאים GCaMP6 לניטור פעילויות אפילפטיפורמיות. המוח כולו מוכן מקאק, גן אפילפסיה ידוע, זבובים להדמיית סידן במיקרוסקופ קונפוקלי כדי לזהות את הפעילות העצבית כהמשך לבדיקת התנהגות דמוית פרכוס. זבובי ה-cac הראו שיעור גבוה יותר של התנהגות דמוית התקפים ופעילויות סידן חריגות, כולל יותר קוצים גדולים ופחות קוצים קטנים מאשר זבובי בר. פעילויות הסידן היו בקורלציה להתנהגות דמוית התקף. מתודולוגיה זו משמשת כמתודולוגיה יעילה בסינון הגנים הפתוגניים לאפילפסיה ובחקר המנגנון הפוטנציאלי של אפילפסיה ברמה התאית.
אפילפסיה, הפרעה נוירולוגית כרונית מורכבת המאופיינת בהישנות של התקפים ספונטניים וללא התגרות ופעילות חריגה ברשת העצבית, השפיעה על יותר מ -70 מיליון אנשים ברחבי העולם, מה שהופך אותה לאחת המחלות הנוירולוגיות הנפוצות ביותר1 ומוביל לנטל כבד של משפחות וחברה. בהתחשב בהשפעת האפילפסיה, נערכו מחקרים רבים לזיהוי האטיולוגיה של התקפים, אשר גנטיקה אושרה כגורם עיקרי לסוגים רבים של אפילפסיה או תסמונות אפילפטיות. בעשורים האחרונים, התקדמות בטכנולוגיות גנומיות הובילה לעלייה מהירה בגילוי גנים חדשים הקשורים לאפילפסיה, הממלאים תפקיד מכריע בהתרחשות פרכוסים, כולל תעלות יונים וגנים שאינם תעלות יונים 3,4
1. פרוטוקול לבדיקה רגישה למפץ
באמצעות פרוטוקול זה, מצאנו כי זבובי קאק הראו שיעורים גבוהים משמעותית של התנהגות דמוית התקף מאשר זבובי WT (17.00 ± 2.99 [n = 6] לעומת 4.50 ± 2.03 [n = 6]; P = 0.0061; מבחן t של תלמיד, איור 1A). רוב זבובי tub-Gal4>UAS-cac-RNAi התאוששו תוך 1-5 שניות, בעוד שזבובי UAS-cac-RNAi התאוששו תוך 2 שני.......
יון הסידן משמש כשליח שני מכריע, וממלא תפקיד מרכזי במגוון תגובות פיזיולוגיות ופתופיזיולוגיות להפרעות כימיות וחשמליות כאחד. יתר על כן, היסוד הטופולוגי של ערוצי P/Q הפרה-סינפטיים, המקודדים על ידי הגן CACNA1A האדם, זוהה כאחראי לתיווך פריקה של מוליכים עצביים שונים, כולל גלוטמט 30,31,32
עבודה זו נתמכה על ידי קרן המחקר הבסיסית והיישומית של גואנגדונג (מענק מס '2022A151111123 לג'ינג-דה קיאו) ותוכנית לשפר את המחקר המדעי ב- GMU (ג'ינג-דה קיאו). עבודה זו נתמכה גם על ידי תוכנית Enihancement Innovation Ability של האוניברסיטה הרפואית של גואנגזו (מימון מס '02-408-2304-02038XM).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Brushes | Panera | AAhc022-2 | for handling flies |
Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C4901 | |
Confocal microscope | SP8; Zeiss, Jena, Germany. | N/A | for calcium imaging |
CO2 anesthesia machine | N/A | N/A | for Anesthetizing the flies. |
C-sharp holder | N/A | N/A | handmade, for mounting the brain |
Culture vials | Biologix | 51-0500 | 2.5 cm diameter, 9.5 cm height |
Fiji software | National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA | version: 2.14.0 | for analysis |
Fly morgue | N/A | N/A | handmade, for handling flies |
Fly stocks | cac-RNAi | 27244 | from Bloomington Drosophila Stock Center |
Fly stocks | GCaMP6m | 42750 | from Bloomington Drosophila Stock Center |
Fly stocks | tub-Gal4 | N/A | from the Sion-Frech Hoffmann Institute, Guangzhou Medical University |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
High-resolution camera | N/A | N/A | for recording the seizure-like behavior assay |
L-lysine | Sigma-Aldrich | L5626 | |
Magnesium chloride solution (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M1028 | |
Papain suspension | Worthington Biochemical | LS003126 | |
Petri dishes | Sigma-Aldrich | SLW1480/02D | for dissection |
Pipette | Thermo Scientific | 4640010, 4640030, 4640050, 4640060 | for transporting a measured volume of liquid and diseccected brain |
Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P4504 | |
Recording dish | Thermo Scientific | 150682- Glass Based Dish | for holding the brain and calcium imaging |
Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S25550 | |
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | S8282 | |
Stereo-binocular microscope | SHANG GUANG | XTZ-D | for handling flies and dissection |
Syringe needles | pythonbio | HCL0693 | for dissection |
Tripod | WEIFENG | 45634732523 | for recording the seizure-like behavior assay |
Vortex mixer | Lab dancer, IKA, Germany/Sigma-Aldrich | Z653438 | for performing the seizure-like behavior assay |
Whiteboard | N/A | N/A | handmade, foam pad or paper for background |
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved