Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Здесь мы представляем протокол визуализации ex vivo кальция у взрослых дрозофил, экспрессирующих GCaMP6, для мониторинга эпилептиформной активности. Протокол предоставляет ценный инструмент для исследования иктальных событий у взрослых дрозофил с помощью визуализации кальция ex vivo , что позволяет исследовать потенциальные механизмы эпилепсии на клеточном уровне.

Abstract

Эпилепсия – это неврологическое расстройство, характеризующееся рецидивирующими припадками, частично коррелированными с генетическим происхождением, которым страдают более 70 миллионов человек во всем мире. Несмотря на клиническое значение эпилепсии, функциональный анализ нервной активности в центральной нервной системе еще предстоит разработать. Недавние достижения в технологии визуализации в сочетании со стабильной экспрессией генетически кодируемых индикаторов кальция, таких как GCaMP6, произвели революцию в изучении эпилепсии как на уровне мозга, так и на уровне отдельных клеток. Drosophila melanogaster появилась как инструмент для исследования молекулярных и клеточных механизмов, лежащих в основе эпилепсии, благодаря своей сложной молекулярной генетике и поведенческим анализам. В этом исследовании мы представляем новый и эффективный протокол визуализации ex vivo кальция у взрослых дрозофил, экспрессирующих GCaMP6, для мониторинга эпилептиформной активности. Весь мозг подготавливается из cac, хорошо известного гена эпилепсии, для визуализации кальция с помощью конфокального микроскопа, чтобы идентифицировать нейронную активность в качестве последующего анализа на судорожное поведение. Мухи-нокдауны CAC показали более высокую частоту судорожного поведения и аномальную активность кальция, включая более крупные шипы и меньшее количество мелких шипов, чем мухи дикого типа. Активность кальция коррелировала с судорожным поведением. Эта методология служит эффективной методологией скрининга патогенных генов эпилепсии и изучения потенциального механизма эпилепсии на клеточном уровне.

Introduction

Эпилепсия, сложное хроническое неврологическое расстройство, характеризующееся рецидивами спонтанных и неспровоцированных припадков и аберрантной активностью нейронной сети, затронула более 70 миллионов человек во всем мире, что делает ее одним из наиболее распространенных неврологическихзаболеваний1 и приводит к тяжелому бремени для семей и общества. Принимая во внимание влияние эпилепсии, было проведено множество исследований для определения этиологии припадков, из которых генетика была признана основной причиной многих типов эпилепсии или эпилептическихсиндромов. За последние десятилетия достижения в области геномных ....

Protocol

1. Протокол для анализа, чувствительного к взрыву

  1. Установить экспериментальные мухи путем скрещивания линии драйвера tub-Gal4 с линией UAS-cac-RNAi через систему21 Gal4/UAS. Соберите девственных мух линии tub-Gal4 и самцов мух линии UAS-cac-RNAi . Затем переложит?.......

Representative Results

Используя этот протокол, мы обнаружили, что мухи с нокдауном cac показали значительно более высокие показатели судорожного поведения, чем мухи WT (17,00 ± 2,99 [n = 6] против 4,50 ± 2,03 [n = 6]; Р = 0,0061; t-критерий Стьюдента, рисунок 1А). Большинство мух tub-Gal4>UAS-cac-RNAi вы.......

Discussion

Ион кальция служит важным вторым мессенджером, играя ключевую роль в ряде физиологических и патофизиологических реакций как на химические, так и на электрические возмущения. Кроме того, топологический элемент пресинаптических P/Q-каналов, кодируемый геном CACNA1A человека, был иденти.......

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Гуандунским фондом фундаментальных и прикладных фундаментальных исследований (грант No 2022A1515111123 Jing-Da Qiao) и планом по расширению научных исследований в GMU (Jing-Da Qiao). Эта работа также была поддержана Планом развития инновационных способностей студентов Медицинского университета Гуанчжоу (No финансирования 02-408-2304-02038XM).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
BrushesPaneraAAhc022-2for handling flies
Calcium chloride (CaCl2)Sigma-AldrichC4901
Confocal microscopeSP8; Zeiss, Jena, Germany.N/Afor calcium imaging
CO2 anesthesia machineN/AN/Afor Anesthetizing the flies.
C-sharp holderN/AN/Ahandmade, for mounting the brain
Culture vialsBiologix51-05002.5 cm diameter, 9.5 cm height
Fiji softwareNational Institutes of Health, Bethesda, MD, USAversion: 2.14.0for analysis
Fly morgueN/AN/Ahandmade, for handling flies
Fly stockscac-RNAi27244from Bloomington Drosophila Stock Center
Fly stocksGCaMP6m42750from Bloomington Drosophila Stock Center
Fly stockstub-Gal4N/Afrom the Sion-Frech Hoffmann Institute, Guangzhou Medical University
GlucoseSigma-AldrichG8270
High-resolution cameraN/AN/Afor recording the seizure-like behavior assay
L-lysineSigma-AldrichL5626
Magnesium chloride solution (MgCl2)Sigma-AldrichM1028
Papain suspensionWorthington BiochemicalLS003126
Petri dishesSigma-AldrichSLW1480/02Dfor dissection
PipetteThermo Scientific4640010, 4640030, 4640050, 4640060for transporting a measured volume of liquid and diseccected brain
Potassium chloride (KCl)Sigma-AldrichP4504
Recording dishThermo Scientific150682- Glass Based Dishfor holding the brain and calcium imaging
Sodium bicarbonate (NaHCO3)Sigma-AldrichS5761
Sodium chloride (NaCl)Sigma-AldrichS5886
Sodium hydroxide (NaOH)Fisher ScientificS25550
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)Sigma-AldrichS8282
Stereo-binocular microscopeSHANG GUANGXTZ-Dfor handling flies and dissection
Syringe needlespythonbioHCL0693for dissection
TripodWEIFENG45634732523for recording the seizure-like behavior assay
Vortex mixerLab dancer, IKA, Germany/Sigma-AldrichZ653438for performing the seizure-like behavior assay
WhiteboardN/AN/Ahandmade, foam pad or paper for background

References

  1. Thijs, R. D., Surges, R., O'brien, T. J., Sander, J. W. Epilepsy in adults. Lancet. 393 (10172), 689-701 (2019).
  2. Ellis, C. A., Petrovski, S., Berkovic, S. F. Epilepsy genetics: Clinical impacts and biological insights. Lancet Neurol. ....

Explore More Articles

ex vivoGCaMP6

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved