פרוטוקול זה מתאר מערך להתגבשות של טרנספורטר הסטרול ABCG5/G8. ABCG5/G8 משוחזר לאופניים לצורך התגבשות טיפה תלויה. הפרוטוקול אינו דורש חומרים או מצעים מיוחדים, מה שהופך אותו לנגיש וקל להתאמה בכל מעבדה לקביעת מבנה החלבון באמצעות קריסטלוגרפיה בקרני רנטגן.
מובילי קסטות קושרות ATP (ABC) מהווים חלבוני קרום משובצי שומנים. מיצוי חלבוני הממברנה הללו מדו-שכבת השומנים לסביבה מימית מושג בדרך כלל על ידי שימוש בדטרגנטים. דטרגנטים אלה מפרקים את דו-שכבת השומנים ומסיסים את החלבונים. בית הגידול הפנימי של חלבוני הממברנה בתוך דו-שכבת השומנים מציב אתגר בשמירה על יציבותם ואחידותם בתמיסה לאפיון מבני. Bicelles, המהווים תערובת של פוספוליפידים ודטרגנטים בעלי שרשרת ארוכה וקצרה, משכפלים את מבנה השומנים הטבעי. השימוש בליפידים, דו-גלגליים ודטרגנטים משמש כמערכת מודל מתאימה לקבלת גבישי עקיפה באיכות גבוהה, במיוחד כדי לקבוע את המבנה ברזולוציה גבוהה של חלבוני ממברנה. באמצעות מיקרו-סביבות סינתטיות אלה, חלבוני הממברנה משמרים את הקונפורמציה והפונקציונליות הטבעית שלהם, ומאפשרים היווצרות של גבישים תלת-ממדיים. בגישה זו, ABCG5/G8 ההטרודימרי המסיס בדטרגנטים שולב מחדש ב-DMPC/CHAPSO bicelles, בתוספת כולסטרול. מערך זה שימש בהליך הניסויי של דיפוזיית אדים להתגבשות חלבונים.
מובילי קלטות קושרות ATP (ABC) מהווים משפחת חלבוני ממברנה האחראית על תהליכי הובלה מגוונים תלויי ATP על פני ממברנות ביולוגיות 1,2,3,4,5. חלבונים טרנספורטרים אלה מעורבים במחלות לב וכלי דם וממלאים תפקיד משמעותי בהקלה על זרימת כולסטרול למרה לצורך הפרשה נוספת בכבד. כתוצאה מכך, חילוף החומרים והאיזון של הכולסטרול זכו להתעניינות רבה לאורך השנים6. מנגנון ספציפי המעורב בסילוק כולסטרול וסטרולים אחרים מהגוף כולל חברים בתת-משפחת ABCG האנושית, במיוחד ABCG5/G8 ההטרודימרי 7,8,9,10. מוטציות בכל אחד מהגנים הללו משבשות את ההטרודימר, מובילות לאובדן תפקוד וגורמות לסיטוסטרולמיה, הפרעה המשפיעה על סחר בסטרולים11,12,13. בהתחשב ברלוונטיות של המחלה ובתפקידם בקידום אפלוקס כולסטרול, מובילי סטרולים משכו תשומת לב משמעותית. אף על פי כן, הפרטים המורכבים של המנגנון המולקולרי שלהם וסלקטיביות המצע שלהם נותרו במידה רבה בלתי נחשפים. לפיכך, הבהרת המבנה הגבישי של ABCG5/G8 היא צעד מכריע לקראת הבנת המנגנונים והתפקודים במורד הזרם בהובלת כולסטרול.
חלבוני ממברנה דורשים עיגון בתוך הממברנות כדי להתקפל ולתפקד כראוי. כתוצאה מכך, מיצוי חלבוני ממברנה מסביבתם הטבעית גורם לעתים קרובות לחוסר יציבות של חלבונים, קיפול שגוי ואובדן תפקוד14,15. אתגרים אלה מדגישים את המשוכות העיקריות העומדות בפני התגבשות חלבון הממברנה. עם זאת, הרכבה מחדש של חלבונים לדו-שכבות של חומרי ניקוי סינתטיים, כמו bicelles, התגלתה כפתרון למצוקה זו, ואפשרה שמירה על חלבוני ממברנה בתוך סביבה דו-שכבתית ילידית16. ביצלות הן מכלולים של פוספוליפידים ודטרגנטים סינתטיים המרחפים ומסיסים במים. יש לציין שהם מאמצים מבנה דו-שכבתי המחקה קרומים ביולוגיים16,17,18. ביצלות יכולות לעבור בין פאזות נוזל וג'ל בהתבסס על טמפרטורה וצמיגות. התגבשות ביצלה מנצלת את הדיסקיות הדו-שכבתיות הקטנות ואת הצמיגות הנמוכה בטמפרטורות מופחתות, מה שמקל על ערבוב יסודי של חלבונים ותמיסות ביצלה. גודל הביצלות תלוי ביחס דטרגנט-ליפידים במהלך ההכנה19,20. הדטרגנטים הנפוצים להיווצרות ביצלה כוללים 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-2-hydroxy-1-propanesulfonate (CHAPSO), יחד עם 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate (CHAPS) ו-1,2-ditridecanoyl-sn-glycerol-3-phosphocholine (DHPC)21. דטרגנטים אלה משמשים בשילוב עם שומנים כגון di-myristoyl-phosphatidylcholine (DMPC) ו 1-palmitoyl-2-oleoyl-phosphatidylcholine (POPC). יתר על כן, מחקרים אחרונים הדגימו את הפונקציונליות המלאה של חלבוני הממברנה בתוך bicelles בתנאים פיזיולוגיים. לדוגמה, לי ועמיתיו התגבשו בהצלחה ודיווחו על המבנה הגבישי של ABCG5/ABCG8 בהתבסס על דו-שכבה דו-שכבתית ליפידית22,23. בתהליך ההתגבשות, ניתן לאכלס תערובות חלבון-ביצלה באמצעות ציוד סטנדרטי, כולל רובוטי התגבשות בעלי תפוקה גבוהה24. עם זאת, ההיתכנות של ניצול הביצלות תלויה ביציבות התרמו-יציבה של החלבונים בשל תנאי ההתגבשות בטמפרטורות גבוהות יותר. עם זאת, בהשוואה לטכניקות אחרות, תנאי ההתגבשות הנדרשים לחלבוני ממברנה נותרים בדרך כלל מתונים, וכוללים ריכוזים נמוכים של משקע, מלח וחיץ. זה הופך הן תערובות חלבון-ביצלה והן דיפוזיה של אדים לכלים יעילים וקלים ליישום למחקרים מבניים של חלבוני ממברנה.
פרוטוקול זה מתאר שלבים חיוניים בהכנת חלבונים ובהתגבשות ביצלה לקביעת המבנה הגבישי של קרני רנטגן של ABCG5/G8 ברזולוציה גבוהה (איור 1).
1. שיבוט וביטוי חלבונים
2. הכנת קרום מיקרוזומלי
3. חלבון הכנה-טיהור של heterodimers
4. הכנת חלבונים-טיפול טרום התגבשות
5. התגבשות חלבונים בביצלות
חצי-טרנספורטרים רקומביננטיים של ABCG5 ו-ABCG8 אנושיים באים לידי ביטוי משותף בשמרי פסטוריס של פיצ'יה . לאחר מכן מחלקים את קרום השמרים באמצעות צנטריפוגה. כפי שמתואר בפרוטוקול זה, החלבונים ההטרודימריים מופקים באמצעות כרומטוגרפיה של עמודת טנדם. לאחר מכן, חלבונים שטופלו מראש כימית מתגבשים על ידי דגירה שלהם עם פוספוליפידים / כולסטרול bicelles. סקירות סכמטיות של תהליכי הטיהור וההתגבשות מוצגות באיור 1.
כדי להעריך את הפיזור של החלבונים המטוהרים, דגימות המכילות 0.01-0.05 מ"ג / מ"ל של חלבונים מוכתמות עם 1%-2% אורניל אצטט. הדגימות האלה נבדקות לאחר מכן באמצעות TEM עם כתם שלילי (איור 2A). על מנת להעריך את יציבות החלבון מבלי לעבור מחזורי הקפאה-הפשרה, נעשה שימוש בכרומטוגרפיית סינון ג'ל אנליטית. ניתוח זה כולל ניטור של אחסון בזמן של חלבונים מטוהרים באמצעות שימוש באליציטוטים קטנים בעלי נפח שווה של החלבונים (איור 2B). ייתכן אובדן קל של חלבונים בשברי השיא לאחר שבוע של דגירה ב -4 מעלות צלזיוס, אולי בגלל צברי חלבונים מסיסים שיורית. עם זאת, תנובת החלבון הכוללת עדיין מספיקה לגידול גבישים. השימוש בכתם שלילי TEM ובכרומטוגרפיית סינון ג'ל אנליטית הוא נוהג סטנדרטי להערכת התאמתם של חלבונים להתגבשות, במיוחד ממבנים מהונדסים שונים.
לצורך הערכת איכות החלבונים בכל שלב בתהליך הכרומטוגרפיה של העמודה, כמו גם לאחר הטיפול הכימי שלפני ההתגבשות, אליציטוטים של שברים המתאימים לשתי עמודות Ni-NTA, שתי עמודות CBP, סינון ג'ל אחד ואלקילציה רדוקטיבית נטענים על ג'ל SDS-PAGE 10% (איור 3). בנוסף, ניתן ליישם את אותה סביבת תגובה המשמשת לאלקילציה עבור תיוג כספית עם אתיל כספית (EMTS), אם כי זה מעבר להיקף המחקר הנוכחי.
גדילת הגבישים מנוטרת מדי יום באמצעות מיקרוסקופ סטריאופוני שולחני המצויד במקטב. גבישים בוגרים ומתאימים לאיסוף נתונים מגיעים בדרך כלל לממדים של 50 מיקרומטר x 100 מיקרומטר x 2 מיקרומטר (איור 4). במהלך תהליך קצירת הגבישים נמנעים במכוון מגבישים או אשכולות קטנים יותר.
איור 1: סקירות סכמטיות לטיהור (A) והתגבשות ביצלה (B) של ABCG5/G8 הטרודימרי. מבנים של ABCG5 אנושי רקומביננטי (hG5) ו- ABCG8 (hG8) נושאים תגי RGS-H 6-G-H6 ו- 3C-CBP, בהתאמה (A, למעלה). כרומטוגרפיית עמודת זיקה טנדם, ואחריה כרומטוגרפיית סינון ג'ל להשגת טיהור הטרודימרי (A, למטה). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הערכה של פיזור חד-פיזור (A) ויציבות (B) של חלבונים מטוהרים. (A) מיקרוגרף אלקטרונים של הטרודימרים מוכתמים שלילית ABCG5/G8 (G5G8) באמצעות TEM. חלקיקים מייצגים מודגשים בעיגולים לבנים מוצקים. סרגל קנה מידה = 100 ננומטר. (B) חלבונים אלקילטים המאוחסנים בטמפרטורה של 4°C שנותחו על ידי כרומטוגרפיית סינון ג'ל אנליטית במשך חודש עם אובדן קל של חלבונים לאחר שבוע. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ניתוח SDS-PAGE של חלבונים המדמים כרומטוגרפיית עמודות ואלקילציה רדוקטיבית. נפחים שונים (1-10 מיקרוליטר) של שברי חלבון הועמסו על ג'ל טריס/גליצין 10% ופעלו במשך 45 דקות במתח קבוע של 200 וולט. הג'ל הוכתם בכחול קומאסי, נעצר, יובש באוויר ונסרק על ידי סורק שולחני. 1° & 2° Ni: טור Ni-NTA הראשון והשני; 1° & 2° CBP: עמודות CBP ראשונה ושנייה; שיא שברים קו מוצק: שברים מאוגמים להתגבשות; שיא שברים מקווקוים: שברי כתף; EMTS: אתיל כספית thiosalicynate; IA: iodoacedamide. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: הערכת הבשלת גבישי חלבון באמצעות מיקרוסקופ אור. גבישים בוגרים של ABCG5/G8 מטיפת התגבשות הודגמו תחת שולחן ומיקרוסקופ סטריאו מצויד במקטב. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
האתגרים הקשורים להתגבשות חלבוני ממברנה הניעו את הפיתוח של שיטות התגבשות מונחות שומנים דו-שכבתיים, כגון גישות bicelle27 או lipid cubic phase (LCP)14 . עם זאת, השגת התגבשות מוצלחת של חלבוני ממברנה עדיין תלויה בשלב הקריטי ולעיתים צוואר הבקבוק של הכנת החלבון. יש לציין כי מובילי ABC מציבים מכשול עצום בגידול גבישים המתאימים לקריסטלוגרפיה של קרני רנטגן. פרוטוקול זה מספק הדרכה מעשית מקיפה לייעול ההכנה של טרנספורטר סטרול ABCG5/G8 אנושי וטיפוח צמיחת גבישים באמצעות גישת התגבשות ביצל.
שיקול מרכזי בתכנון פרוטוקול זה היה הצורך בתפוקת חלבון משמעותית בשלבים הראשונים של טיהור החלבון, המאפשרת מידה מסוימת של אובדן חלבון במהלך הטיפול שלפני ההתגבשות (איור 3). אסטרטגיות נפוצות להתמודדות עם אתגר זה כוללות הנדסת חלבונים נרחבת, ניצול של מארחי ביטוי מגוונים, וחקר אורתולוגים או הומולוגים, בין גישות אחרות. עם זאת, עם הליך מורכב לכאורה זה, זוהו מספר צעדים מרכזיים העומדים בבסיס הצלחת הפרוטוקול וגם מספקים תובנות לגבי מגבלות פוטנציאליות שעשויות להתעורר בעת חקר מובילי ABC אחרים או חלבוני ממברנה בכלל.
ראשית, פרוטוקול זה משתמש בצנטריפוגה יסודית בכל שלב כדי למזער את צבירת החלבונים. בנוסף, ניטור רציף של היציבות התרמו-יציבה של החלבונים המטוהרים הוא חיוני. מיקרוסקופ אלקטרונים משמש לאימות חד-פיזור חלבון, בעוד סינון ג'ל אנליטי עוקב אחר יציבות החלבון לאורך זמן (איור 2). ניתן לשלב גם טכניקות חלופיות כמו דיכרואיזם מעגלי (CD) או קלורימטריה סריקה דיפרנציאלית (DSC). יתר על כן, שילוב של שומנים בשלבים ספציפיים הוא חיוני כדי למקסם הן את הפעילות ואת הקריסטלונזה של ABCG5 / G8 מטוהר. לדוגמה, cholate ו- CHS נחוצים כדי להציג הידרוליזה ATP מדידה; פוספוליפידים הם הכרחיים לשמירה על יציבותם של חלבונים מתילציה; וכולסטרול הוא מרכיב הכרחי בתמיסת ביצלה, המעודד צמיחת גבישים המתאימים לעקיפה של קרני רנטגן ברזולוציה גבוהה (איור 4).
בעיקרו של דבר, ניתן לבצע את ההליך כולו תוך מאמץ של שבוע. בניגוד ל-LCP, שליפת גבישים ממגשי התגבשות תלויים היא פשוטה. במבט קדימה, עם תפוקת חלבון משמעותית (כ-10 מ"ג), פרוטוקול זה ניתן להתאמה בקלות לפיתוח חקירות קריסטלוגרפיות המערבות מוטנטים ABCG5/G8 או חלבוני טרנספורטר אחרים. זה רלוונטי במיוחד למקרים שכיום מתחמקים מהדמיה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים.
עבודה זו נתמכת על ידי מענק גילוי של מועצת המחקר למדעי הטבע וההנדסה (RGPIN 2018-04070) ומענק פרויקט מחקר של המכונים הקנדיים לבריאות (PJT-180640) ל- JYL. פרוטוקול זה מבוסס על הדיווחים המקוריים במבנים גבישיים ABCG5/G8 שדווחו קודם לכן על ידי Farhat et al.22 ו- Lee et al.23.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
(NH4)2SO4 | MilliporeSigma | A4915 | |
ABCG5 | National Institute of Health collection | NCBI accession number NM_022436 | |
ABCG8 | National Institute of Health collection | NCBI accession number NM_022437 | |
ÄKTA FPLC system | Cytiva (formerly GE Healthcare Life Sciences) | ||
CaCl2 | Wisent | 600-024-CG | Anhydrous |
CBP | Agilent | 214303 | Calmodulin binding peptide affinity resin |
Centrifugal concentrators (Vivaspin) | Sartorius | ||
CHAPSO | Anatrace | C317 | Anagrade |
Cholesterol | Anatrace | CH200 | |
CHS | Steraloids | C6823-000 | |
DMAB | MilliporeSigma | 180238 | 97% |
DMNG | Anatrace | NG322 | |
DMPC | Anatrace | D514 | |
DOPC | Avanti | 850375 | |
DOPC | Anatrace | D518 | |
DOPE | Avanti | 850725 | |
DTT | Fisher | BP172 | |
Dual Thickness MicroLoops | MiTeGen | ||
EDTA | BioShop | EDT003 | Disodium salt, dihydrate |
EGTA | MilliporeSigma | 324626 | |
Emulsifier (EmulsiFex-C3) | Avestin | ||
Endo H | New England Biolabs | P0702 | |
Ethanol | Greenfield | P016EAAN | Ethyl Alcohol Anhydrous |
Formaldehyde | MilliporeSigma | 252549 | ACS Reagent |
Glycerol | BioShop | GLY004 | |
HEPES | BioShop | HEP001 | |
HRV-3C protease | Homemade | ||
Imidazole | BioShop | IMD510 | Reagent grade |
Iodoacetamide | MilliporeSigma | I1149 | BioUltra |
Isopropanol | Fisher | BP2618212 | |
Leupeptin | BioShop | LEU001 | |
MES | MilliporeSigma | 69892 | BioUltra |
Methanol | Fisher | A412P | |
MgCl2 | Wisent | 800-070-CG | Hydrated |
microfluidizer (LM 20) | Microfluidics | ||
NaCl | BioShop | SOD002 | |
NH4OH | Fisher | A669-212 | ACS Reagent |
Ni-NTA superflow | Qiagen | 30430 | Nickel-charged resins |
PEG 400 | MilliporeSigma | 202398 | |
Pepstatin | BioShop | PEP605 | |
PMSF | MilliporeSigma | P7626 | |
pSGP18 and pLIC | Homemade (derived from pPICZ, Invitrogen) | ||
SDS | BioShop | SDS003 | |
Sodium cholate | Fisher | 229101 | |
Sodium malonate | MilliporeSigma | 63409 | |
Sucrose | Wisent | 800-081-WG | Ultra pure |
Superdex 200 30/100 GL | Cytiva (formerly GE Healthcare Life Sciences) | 28990944 | Prepacked gel-filtration column |
TCEP | |||
TEM | FEI, Technai | ||
Tris Base | Fisher | BP152 | |
β-DDM | Anatrace | D310S | Sol Grade |
β-mercaptoethanol | MilliporeSigma | ||
ε-aminocaproic acid | Fisher | AAA1471936 |
Explore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved