Этот протокол описывает установку для кристаллизации переносчика стерола ABCG5/G8. ABCG5/G8 восстанавливается в бицеллы для кристаллизации в виде висячей капли. Протокол не требует специализированных материалов или подложек, что делает его доступным и легким для адаптации в любой лаборатории для определения структуры белка с помощью рентгеновской кристаллографии.
Транспортеры АТФ-связывающей кассеты (АВС) представляют собой мембранные белки, внедренные в липиды. Извлечение этих мембранных белков из липидного бислоя в водную среду обычно достигается с помощью детергентов. Эти детергенты разрушают липидный бислой и растворяют белки. Внутренняя среда обитания мембранных белков в липидном бислое создает проблему в поддержании их стабильности и однородности в решении для структурной характеристики. Бицеллы, которые включают в себя смесь длинноцепочечных и короткоцепочечных фосфолипидов и детергентов, воспроизводят естественную липидную структуру. Использование липидных бицелл и детергентов служит подходящей модельной системой для получения высококачественных дифракционных кристаллов, в частности, для определения структуры мембранных белков с высоким разрешением. Благодаря этим синтетическим микросредам мембранные белки сохраняют свою естественную конформацию и функциональность, способствуя образованию трехмерных кристаллов. При таком подходе растворимый в детергенте гетеродимерный ABCG5/G8 реинтегрировали в бицеллы DMPC/CHAPSO, дополненные холестерином. Эта установка была использована в экспериментальной процедуре диффузии пара для кристаллизации белка.
АТФ-связывающие кассетные транспортеры (АВС) представляют собой суперсемейство мембранных белков, ответственных за различные АТФ-зависимые транспортные процессы через биологические мембраны 1,2,3,4,5. Эти белки-переносчики участвуют в сердечно-сосудистых заболеваниях и играют важную роль в облегчении оттока холестерина в желчь для последующего выведения в печень. Следовательно, метаболизм и баланс холестерина привлекли значительный интерес на протяжениимногих лет. Специфический механизм, участвующий в выведении холестерина и других стеринов из организма, включает членов подсемейства ABCG человека, в частности, гетеродимерных ABCG5/G8 7,8,9,10. Мутации в любом из этих генов нарушают гетеродимер, приводя к потере функции и вызывая ситостеролемию, расстройство, влияющее на транспорт стеринов11,12,13. Учитывая актуальность заболевания и их роль в стимулировании оттока холестерина, переносчики стеринов привлекли значительное внимание. Тем не менее, сложные детали их молекулярного механизма и субстратной селективности остаются в значительной степени нераскрытыми. Таким образом, выяснение кристаллической структуры ABCG5/G8 является важным шагом на пути к пониманию механизмов и нисходящих функций в транспорте холестерина.
Мембранные белки требуют закрепления внутри мембран, чтобы сворачиваться и функционировать правильно. Следовательно, извлечение мембранных белков из их естественной среды часто приводит к нестабильности белка, неправильному сворачиванию и потере функции14,15. Эти проблемы подчеркивают основные препятствия, с которыми приходится сталкиваться при кристаллизации мембранных белков. Тем не менее, восстановление белков в синтетические бислои детергента, такие как бицеллы, появилось в качестве решения этой проблемы, позволяя поддерживать мембранные белки в среде, подобной нативной бислойнойсреде. Бицеллы представляют собой скопления синтетических фосфолипидов и моющих средств, взвешенных и растворенных в воде. Примечательно, что они принимают двухслойную структуру, которая имитирует биологические мембраны16,17,18. Бицеллы могут переходить из жидкой и гелевой фаз в зависимости от температуры и вязкости. Кристаллизация бицелл основана на небольших двухслойных дисках и низкой вязкости при пониженных температурах, что способствует тщательному смешиванию белков и растворов бицелл. Размер бицелл зависит от соотношения детергента и липидов при приготовлении 19,20. Преобладающими детергентами для образования бицелл являются 3-[(3-холамидопропил)диметиламмонио]-2-гидрокси-1-пропансульфонат (CHAPSO), а также 3-[(3-холамидопропил)диметиламмонио]-1-пропансульфонат (CHAPS) и 1,2-дитридеканоил-sn-глицерин-3-фосфохолин (DHPC)21. Эти моющие средства используются в сочетании с липидами, такими как димиристоилфосфатидилхолин (ДМПК) и 1-пальмитоил-2-олеоил-фосфатидилхолин (ПОПК). Кроме того, недавние исследования продемонстрировали полную функциональность мембранных белков внутри бицелл в физиологических условиях. Например, Ли и его коллеги успешно кристаллизовали и сообщили о кристаллической структуре ABCG5/ABCG8 на основе липидного бислоя22,23. В процессе кристаллизации белково-бицеллярные смеси могут размещаться с использованием стандартного оборудования, в том числе высокопроизводительных кристаллизационных роботов24. Возможность использования бицелл, однако, зависит от термостабильности белков из-за условий кристаллизации при более высоких температурах. Тем не менее, по сравнению с другими методами, необходимые условия кристаллизации мембранных белков обычно остаются мягкими, с низкими концентрациями осадка, соли и буфера. Это делает как белково-бицеллярные смеси, так и диффузию пара эффективными и легко реализуемыми инструментами для структурных исследований мембранных белков.
В этом протоколе описаны основные этапы подготовки белка и кристаллизации бицелл для определения рентгеновской кристаллической структуры ABCG5/G8 с высоким разрешением (рис. 1).
1. Клонирование и экспрессия белка
2. Препарирование микросомальной мембраны
3. Белковый препарат-очистка гетеродимеров
4. Подготовка белка - предкристаллизационная обработка
5. Кристаллизация белка в бицеллах
Рекомбинантные полупереносчики ABC, человеческие ABCG5 и ABCG8, экспрессируются совместно с дрожжами Pichia pastoris . Затем дрожжевая мембранная фракция фракционируется с помощью центрифугирования. Как указано в этом протоколе, гетеродимерные белки экстрагируются с помощью хроматографии с тандемной колонкой. Затем предварительно химически обработанные белки кристаллизуют путем их инкубации с фосфолипидными/холестериновыми бицеллами. Схематические обзоры процессов очистки и кристаллизации представлены на рисунке 1.
Для оценки монодисперсности очищенных белков образцы, содержащие 0,01-0,05 мг/мл белков, окрашивают 1%-2% уранилацетатом. Затем эти образцы исследуют с помощью ПЭМ с отрицательным окрашиванием (рис. 2А). Для оценки стабильности белка без прохождения циклов замораживания-оттаивания используется аналитическая гель-фильтрационная хроматография. Этот анализ включает в себя мониторинг временного хранения очищенных белков с использованием небольших аликвот белков равного объема (рис. 2B). После недели инкубации при 4 °C может наблюдаться небольшая потеря белков на пиковых фракциях, возможно, из-за остаточных растворимых белковых агрегатов. Тем не менее, общий выход белка остается достаточным для роста кристаллов. Использование ПЭМ с отрицательным окрашиванием и аналитической гель-фильтрационной хроматографии является стандартной практикой для оценки пригодности белков для кристаллизации, особенно из различных инженерных конструкций.
Для оценки качества белка на каждом этапе процесса колоночной хроматографии, а также после предкристаллизационной химической обработки на 10%-ный гель SDS-PAGE загружают аликвоты фракций, соответствующих двум колонкам Ni-NTA, двум колонкам CBP, одной гелевой фильтрации и восстановительному алкилированию (рис. 3). Кроме того, та же реакционная среда, используемая для алкилирования, может быть применена для мечения ртути этилртутью (EMTS), хотя это выходит за рамки настоящего исследования.
За ростом кристаллов ежедневно следят с помощью настольного стереомикроскопа, оснащенного поляризатором. Зрелые кристаллы, пригодные для сбора данных, обычно достигают размеров 50 мкм x 100 мкм x 2 мкм (рис. 4). В процессе сбора кристаллов намеренно избегаются более мелкие кристаллы или кластеры.
Рисунок 1: Схематические обзоры очистки (A) и бицеллярной кристаллизации (B) гетеродимерных ABCG5/G8. Конструкции рекомбинантных человеческих ABCG5 (hG5) и ABCG8 (hG8) несут метки RGS-H 6-G-H6 и 3C-CBP соответственно (А, вверху). Тандемная сродственная колоночная хроматография с последующей гель-фильтрационной хроматографией для достижения гетеродимерной очистки (А, внизу). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Оценка монодисперсности (А) и стабильности (В) очищенных белков . (A) Электронная микрофотография отрицательно окрашенных гетеродимеров ABCG5/G8 (G5G8) с использованием ПЭМ. Репрезентативные частицы выделены сплошными белыми кружками. Масштабная линейка = 100 нм. (B) Алкилированные белки, хранящиеся при 4 °C, анализируются методом аналитической гель-фильтрационной хроматографии в течение месяца с незначительной потерей белков через неделю. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: SDS-PAGE анализ белковых элюатов колоночной хроматографии и восстановительного алкилирования. Различные объемы (1-10 мкл) белковых фракций загружали на 10% гель трис/глицина и запускали в течение 45 мин при постоянном напряжении 200 В. Гель был окрашен синим цветом Кумасси, обесцвечен, высушен на воздухе и отсканирован настольным сканером. 1° и 2° Ni: первая и вторая Ni-NTA колонны; 1° и 2° CBP: первая и вторая колонны CBP; Сплошная линия Peak Fractions: объединенные фракции для кристаллизации; Пиковые дроби пунктирной линией: доли плеча; ЭМТС: тиосалицинат этилртути; ИА: йодоацедамид. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Оценка созревания кристаллов белка методом световой микроскопии. Зрелые кристаллы ABCG5/G8 из кристаллизационной капли визуализировали под настольным стереомикроскопом, оснащенным поляризатором. Масштабная линейка = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Проблемы, связанные с кристаллизацией мембранных белков, послужили толчком к разработке методов кристаллизации, основанных на бипидном бислое, таких как бицелла27 или липидная кубическая фаза (LCP)14 . Тем не менее, достижение успешной кристаллизации мембранных белков по-прежнему зависит от критического и иногда узкого этапа подготовки белка. Примечательно, что переносчики ABC представляют собой серьезное препятствие для выращивания кристаллов, пригодных для рентгеновской кристаллографии. Этот протокол содержит всестороннее практическое руководство по рационализации подготовки человеческого транспортера стеринов ABCG5/G8 и стимулированию роста кристаллов с помощью подхода к кристаллизации бицелл.
Ключевым фактором при разработке этого протокола было требование значительного выхода белка на начальных этапах очистки белка, что позволило бы обеспечить определенную степень потери белка во время предварительной кристаллизационной обработки (рис. 3). Общие стратегии решения этой проблемы включают в себя, среди прочего, обширную белковую инженерию, использование различных экспрессионных хозяев и исследование ортологов или гомологов. Тем не менее, с помощью этой, казалось бы, сложной процедуры был определен ряд ключевых шагов, которые лежат в основе успеха протокола, а также дают представление о потенциальных ограничениях, которые могут возникнуть при изучении других транспортеров ABC или мембранных белков в целом.
Во-первых, этот протокол использует тщательное центрифугирование на каждом этапе, чтобы свести к минимуму агрегацию белков. Кроме того, постоянный контроль термостабильности очищенных белков имеет решающее значение. Электронная микроскопия используется для проверки монодисперсности белка, в то время как аналитическая фильтрация геля отслеживает стабильность белка с течением времени (рис. 2). Также могут быть использованы альтернативные методы, такие как циркулярный дихроизм (КД) или дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК). Кроме того, включение липидов на определенных стадиях имеет важное значение для максимизации как активности, так и кристаллогенеза очищенного ABCG5/G8. Например, холат и CHS необходимы для осуществления измеримого гидролиза АТФ; фосфолипиды незаменимы для поддержания стабильности метилированных белков; а холестерин является необходимым компонентом раствора бицеллы, способствуя росту кристаллов, пригодных для рентгеновской дифракции высокого разрешения (рис. 4).
По сути, вся процедура может быть выполнена в течение недели усилий. В отличие от LCP, извлечение кристаллов из кристаллизационных лотков с висячей каплей является простым. Забегая вперед, можно сказать, что при значительном выходе белка (около 10 мг) этот протокол легко адаптируется для разработки кристаллографических исследований с участием мутантов ABCG5/G8 или других белков-переносчиков. Это особенно актуально для случаев, которые в настоящее время не поддаются визуализации с помощью электронной микроскопии.
Эта работа поддержана грантом Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям (RGPIN 2018-04070) и грантом Канадского института исследований в области здравоохранения (PJT-180640) для JYL. Этот протокол основан на оригинальных отчетах по кристаллическим структурам ABCG5/G8, о которых сообщалось ранее Farhat et al.22 и Lee et al.23.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
(NH4)2SO4 | MilliporeSigma | A4915 | |
ABCG5 | National Institute of Health collection | NCBI accession number NM_022436 | |
ABCG8 | National Institute of Health collection | NCBI accession number NM_022437 | |
ÄKTA FPLC system | Cytiva (formerly GE Healthcare Life Sciences) | ||
CaCl2 | Wisent | 600-024-CG | Anhydrous |
CBP | Agilent | 214303 | Calmodulin binding peptide affinity resin |
Centrifugal concentrators (Vivaspin) | Sartorius | ||
CHAPSO | Anatrace | C317 | Anagrade |
Cholesterol | Anatrace | CH200 | |
CHS | Steraloids | C6823-000 | |
DMAB | MilliporeSigma | 180238 | 97% |
DMNG | Anatrace | NG322 | |
DMPC | Anatrace | D514 | |
DOPC | Avanti | 850375 | |
DOPC | Anatrace | D518 | |
DOPE | Avanti | 850725 | |
DTT | Fisher | BP172 | |
Dual Thickness MicroLoops | MiTeGen | ||
EDTA | BioShop | EDT003 | Disodium salt, dihydrate |
EGTA | MilliporeSigma | 324626 | |
Emulsifier (EmulsiFex-C3) | Avestin | ||
Endo H | New England Biolabs | P0702 | |
Ethanol | Greenfield | P016EAAN | Ethyl Alcohol Anhydrous |
Formaldehyde | MilliporeSigma | 252549 | ACS Reagent |
Glycerol | BioShop | GLY004 | |
HEPES | BioShop | HEP001 | |
HRV-3C protease | Homemade | ||
Imidazole | BioShop | IMD510 | Reagent grade |
Iodoacetamide | MilliporeSigma | I1149 | BioUltra |
Isopropanol | Fisher | BP2618212 | |
Leupeptin | BioShop | LEU001 | |
MES | MilliporeSigma | 69892 | BioUltra |
Methanol | Fisher | A412P | |
MgCl2 | Wisent | 800-070-CG | Hydrated |
microfluidizer (LM 20) | Microfluidics | ||
NaCl | BioShop | SOD002 | |
NH4OH | Fisher | A669-212 | ACS Reagent |
Ni-NTA superflow | Qiagen | 30430 | Nickel-charged resins |
PEG 400 | MilliporeSigma | 202398 | |
Pepstatin | BioShop | PEP605 | |
PMSF | MilliporeSigma | P7626 | |
pSGP18 and pLIC | Homemade (derived from pPICZ, Invitrogen) | ||
SDS | BioShop | SDS003 | |
Sodium cholate | Fisher | 229101 | |
Sodium malonate | MilliporeSigma | 63409 | |
Sucrose | Wisent | 800-081-WG | Ultra pure |
Superdex 200 30/100 GL | Cytiva (formerly GE Healthcare Life Sciences) | 28990944 | Prepacked gel-filtration column |
TCEP | |||
TEM | FEI, Technai | ||
Tris Base | Fisher | BP152 | |
β-DDM | Anatrace | D310S | Sol Grade |
β-mercaptoethanol | MilliporeSigma | ||
ε-aminocaproic acid | Fisher | AAA1471936 |
Explore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved