Stanford Fonksiyonel Genomik Tesisi'ne (SFGF), özellikle Dhananjay Wagh ve John Coller'a ve 10x Genomics'e deneylerimizi optimize etmedeki yardımları için teşekkür ederiz. Ayrıca Dr. George Poultsides, Monica Dua, Brendan Visser ve Byrne Lee'ye hasta örneklerinin alınmasındaki yardımları için teşekkür ederiz. Art ve Elaine Taylor'a, Rantz Vakfı'na ve Warren ve Judy Kaplan'a araştırma çabalarımıza cömert destekleri için teşekkür ederiz. Finansman kaynakları arasında NIH hibeleri 1F32CA23931201A1 (DSF), 1R01GM116892 (MTL), 1R01GM136659 (MTL), Goldman Sachs Vakfı (J.A.N., D.S.F., M.T.L.), Damon Runyon Kanser Araştırma Vakfı (D.D., M.T.L.), Gunn/Olivier Fonu, California Rejeneratif Tıp Enstitüsü, Stinehart/Reed Vakfı ve Hagey Pediatrik Rejeneratif Tıp Laboratuvarı. Sıralama, NIH fonlarıyla satın alınan makineler (S10OD025212, S10OD018220 ve 1S10OD01058001A1) kullanılarak elde edildi.

İnsan pankreas kanseri (pankreatik duktal adenokarsinom) örnekleri laboratuvarımızda IRB onaylı bir protokole göre alındı. Doku toplanması için hastalardan bilgilendirilmiş onam alındı. Doku ameliyathaneden laboratuvara taşındı ve daha sonra aşağıdaki gibi işlendi.
1. Doku ayrışması (sindirim)
<ol><li>Özet Tamponu Hazırlayın ( Malzeme Tablosuna bakın).</li>
	<li>Tümör eksizyonundan sonra mümkün olan en kısa sürede ilgilenilen...

Katı Tümör Örneğinde Multiom Dizileme için Çekirdek İzolasyonu

<ol>
	<li>Jain, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+and+spatial+transcriptomics+reveal+cancer-associated+fibroblasts+in+glioblastoma+with+protumoral+effects.">Single-cell RNA sequencing and spatial transcriptomics reveal cancer-associated fibroblasts in glioblastoma with protumoral effects.</a> J Clin Invest. 133 (5), e147087 (2023).</li><li>Sahai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+framework+for+advancing+our+understanding+of+cancer-associated+fibroblasts.">A framework for advancing our understanding of cancer-associated fibroblasts.</a> Nat Rev Cancer. 20 (3), 174-186 (2020).</li><li>Foster, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiomic+analysis+reveals+conservation+of+cancer-associated+fibroblast+phenotypes+across+species+and+tissue+of+origin.">Multiomic analysis reveals conservation of cancer-associated fibroblast phenotypes across species and tissue of origin.</a> Cancer Cell. 40 (11), 1392-1406 (2022).</li><li>Hasan, S., Buechler, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What's+in+a+name?+An+emerging+framework+for+cancer-associated+fibroblasts,+myofibroblasts,+and+fibroblasts.">What's in a name? An emerging framework for cancer-associated fibroblasts, myofibroblasts, and fibroblasts.</a> Cancer Cell. 40 (11), 1273-1275 (2022).</li><li>. Nuclei isolation from complex tissues for single cell multiome ATAC + gene expression sequencing Available from: <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-from-complex-tissues-for-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-sequencing">https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-from-complex-tissues-for-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-sequencing</a> (2022)</li><li>. Nuclei isolation from embryonic mouse brain tissue for single cell multiome ATAC + gene expression sequencing Available from: <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-from-embryonic-mouse-brain-tissue-for-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-sequencing">https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-from-embryonic-mouse-brain-tissue-for-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-sequencing</a> (2022)</li><li>Januszyk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+diabetic+and+non-diabetic+foot+ulcers+using+single-cell+RNA-sequencing.">Characterization of diabetic and non-diabetic foot ulcers using single-cell RNA-sequencing.</a> Micromachines (Basel). 11 (9), 815 (2020).</li><li>Foster, D. S., Jones, R. E., Ransom, R. C., Longaker, M. T., Norton, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolving+relationship+of+wound+healing+and+tumor+stroma.">The evolving relationship of wound healing and tumor stroma.</a> JCI Insight. 3 (18), e99911 (2018).</li><li>Nott, A., Schlachetzki, J. C. M., Fixsen, B. R., Glass, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclei+isolation+of+multiple+brain+cell+types+for+omics+interrogation.">Nuclei isolation of multiple brain cell types for omics interrogation.</a> Nat Protoc. 16 (3), 1629-1646 (2021).</li><li>Foster, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+spatial+multiomics+reveals+fibroblast+fate+during+tissue+repair.">Integrated spatial multiomics reveals fibroblast fate during tissue repair.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (41), e2110025118 (2021).</li><li>Leiz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclei+isolation+from+adult+mouse+kidney+for+single-nucleus+RNA-sequencing.">Nuclei isolation from adult mouse kidney for single-nucleus RNA-sequencing.</a> J Vis Exp. (175), (2021).</li><li>Narayanan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclei+isolation+from+fresh+frozen+brain+tumors+for+single-nucleus+RNA-seq+and+ATAC-seq.">Nuclei isolation from fresh frozen brain tumors for single-nucleus RNA-seq and ATAC-seq.</a> J Vis Exp. (162), e61542 (2020).</li></ol>

Tümör mikroçevresinde bulunan heterojen hücre popülasyonlarının çözülmesi, kanser biyolojisinde aktif bir odak alanıdır. Benzer şekilde, yara iyileşmesi ve fibrozis gibi iyi huylu patolojilerde karmaşık dokular bulunur. Çoklu dizileme, aynı hücreli eşleştirilmiş scRNA ve ATAC-seq verilerinin elde edilmesine izin veren güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Bu protokol, taze, kırılgan, küçük tümör örneklerinin işlenmesi ortamında optimizasyon gerektiren çekirdeklerin izolasyonunu...

Tümör biyolojisi hakkındaki bilgimiz arttıkça, tümör mikroçevresindeki heterojen hücreleri analiz etmenin önemi de artmıştır 1,2. Tek hücreli RNA elde etme yeteneği ve aynı hücreden eşleştirilmiş hücre tarzında (multiomlu dizileme) dizileme (ATAC-dizileme) verileriyle transpozaz erişilebilir kromatin testi, bu amaca doğru önemli bir ilerleme sağlar 3,4. Bununla birlikte, bu deneyler pahalı ve zaman alıcıdır ve elde edilen verilerin kalitesi ve etkisi, deney koşullarının ve malzemelerinin kalitesine büyük ölçüde bağlıdır. Çekirdek izolasyonu için standartlaştırılmış protokoller yayınlanmıştır 5,6. Katı tümör örneklerinden yeni izole edilen hücreler, hücre hatlarından izole edilenlerden daha kırılgan olduğundan, taze ve heterojen dokular protokol optimizasyonu gerektirir.
Diğer bir husus, katı tümörler için cerrahi örneklerin genellikle ameliyathaneden günün geç saatlerine kadar temin edilememesidir. Bu nedenle, bir kriyoprezervasyon adımı olmadan doğrudan numune alımından çekirdek yakalamaya geçmek genellikle mümkün değildir. Deneyimlerimize göre, tek hücreli bir süspansiyonun dondurulması, en yüksek kalitede çekirdekleri verir (hızlı donmuş tüm doku veya diğer koruma yöntemleri yerine). Bu, özellikle pankreas gibi yüksek RNaz içeriğine sahip enzimatik doku tipleri için geçerlidir.
Doku sindirim koşullarının da kaliteden ödün vermeden hücre verimini en üst düzeye çıkaracak şekilde tasarlanması gerekir7. Yoğun desmoplastik matrislere8 sahip katı tümör tipleri bağlamında, hücre dışı matrisin hücre salınımı için nazikçe parçalanması gerekir. Ek olarak, izole edilen hücre tipleri heterojen olduğundan, koşullar toplam hücre popülasyonunu destekleyecek şekilde ayarlanmalıdır. Açıklanan protokolde insan pankreas kanseri (pankreatik duktal adenokarsinom) örnekleri kullanılmaktadır. Pankreas kanseri, nispeten yapışkan doku ve hücrelere işaret eden oldukça desmoplastik bir tümör tipini temsil eder. Ayrıca, araştırma için mevcut pankreas tümörü örnekleri de nispeten küçük olma eğiliminde olduğundan, yakalanan hücre miktarını en üst düzeye çıkarmak için çaba sarf edilmektedir.
Çekirdeklerin izolasyonu, hücre lizis koşulları ve zamanlamasının yanı sıra reaktif türleri ve oranları açısından en fazla optimizasyonu gerektirir. Çekirdeklerin izolasyon sırasında ele alınması da büyük özen gerektirir. Bu makalede, katı tümör dokusundan 10x Genomics multiom dizileme platformu için nükleer izolasyonu optimize etme deneyimimizi açıklıyoruz (Şekil 1). Doku sindirimi, tek hücreli süspansiyonların dondurularak saklanması (istenirse) ve nükleer izolasyon için önerilerde bulunuyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100, 70, and 40 &#956;m Falcon cell strainers&#160;</td>
			<td>&#160;ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Genomics Nuclei Buffer (20x)</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>2000153/2000207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bambanker&#160;</td>
			<td>Wako, Fisher Scientitic</td>
			<td>NC9582225&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>499609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase (Collagenase Type IV)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17104019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>BN2006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS006330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>646563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium F-12</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11320082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10438026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowmi 40 &#956;m&#160; Pipette Tip Cell Strainer&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>BAH136800040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histopaque-1119 Gradient Cell Separation solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miltenyi GentleMACSTM digest kit&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>59222C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Cryo &#34;Mr. Frosty&#34; Freezing Container</td>
			<td>&#160;ThermoFisher</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonident P40 Substitute</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poloxamer 188</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase inhibitor&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>3335399001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T2194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>85113</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimized nuclei isolation from fresh and frozen solid tumor specimens for multiome sequencing

Aynı hücreli/eşleştirilmiş tek hücreli RNA- ve dizileme (ATAC-dizileme) verileriyle transpozaz erişilebilir kromatin tahlili sağlayan çoklu dizileme, tümör hücresi heterojenliğini ayırt etme yeteneğimizde bir atılımı temsil ediyor - şu anda translasyonel kanser araştırmalarının birincil odak noktası. Bununla birlikte, bu gelişmiş modalite kullanılarak elde edilen sıralama verilerinin kalitesi, büyük ölçüde girdi malzemesinin kalitesine bağlıdır. 
Kaliteden ödün vermeden hücre verimini en üst düzeye çıkarmak için sindirim koşullarının optimize edilmesi gerekir. Bu, hücre salınımı için nazikçe parçalanması gereken yoğun desmoplastik matrislere sahip katı tümörler bağlamında özellikle zordur. Katı tümör dokusundan yeni izole edilmiş hücreler, hücre hatlarından izole edilenlerden daha kırılgandır. Ek olarak, izole edilen hücre tipleri heterojen olduğundan, toplam hücre popülasyonunu destekleyecek koşullar seçilmelidir. 
Son olarak, nükleer izolasyon koşulları, lizis süreleri ve reaktif türleri/oranları açısından bu niteliklere göre optimize edilmelidir. Bu yazıda, katı tümör örneklerinden 10x Genomics multiomum dizileme platformu için nükleer izolasyon deneyimimizi açıklıyoruz. Doku sindirimi, tek hücreli süspansiyonların saklanması (istenirse) ve nükleer izolasyon ve değerlendirme için önerilerde bulunuyoruz.

As our knowledge of tumor biology grows, the importance of analyzing heterogeneous cells across the tumor microenvironment has also increased1,2. The ability to acquire single-cell RNA and the assay for transposase-accessible chromatin with sequencing (ATAC-sequencing) data from the same cell in a paired-cell fashion (multiome sequencing) provides a significant advance towards this end3,4. These experiments are expensive and time-consuming, however, and the quality and impact of the data acquired are highly dependent on the quality of the experimental conditions and materials. Standardized protocols for nuclei isolation have been published5,6. Fresh and heterogeneous tissues require protocol optimization since freshly isolated cells from solid tumor specimens are more fragile than those isolated from cell lines.
Another consideration is that for solid tumors, surgical specimens are often not available from the operating room until late in the day. As such, it is generally not feasible to proceed directly from sample acquisition to nuclei capture without a cryopreservation step. In our experience, freezing a single-cell suspension yields the highest-quality nuclei (rather than flash-frozen whole tissue or other modalities of preservation). This is particularly true for enzymatic tissue types with high RNase content such as the pancreas.
Tissue digestion conditions also need to be designed to maximize cell yield without sacrificing quality7. In the context of solid tumor types with dense desmoplastic matrices8, the extracellular matrix must be gently broken down for cell release. Additionally, because the cell types isolated are heterogeneous, conditions should be adjusted to support the total cell population. Human pancreatic cancer (pancreatic ductal adenocarcinoma) samples are used in the described protocol. Pancreatic cancer represents a highly desmoplastic tumor type, which portends relatively sticky tissue and cells. Moreover, as pancreatic tumor specimens available for research also tend to be relatively small, efforts are made to maximize the quantity of cells captured.
Isolation of nuclei requires the most optimization in terms of cell lysis conditions and timing, as well as reagent types and ratios. Handling the nuclei over the course of isolation also requires great care. In this article, we describe our experience optimizing nuclear isolation for the 10x Genomics multiome sequencing platform from solid tumor tissue (Figure 1). We provide recommendations for tissue digestion, cryopreservation of single-cell suspensions (if desired), and nuclear isolation.

Yazar Gündemi: Zorlu Tümör Mikro Ortamlarında Çoklu Dizileme için Çekirdek İzolasyonunun Geliştirilmesi

Çoklu Dizileme için Taze ve Dondurulmuş Katı Tümör Örneklerinden Optimize Edilmiş Çekirdek İzolasyonu

As our knowledge of tumor biology grows and interest to understand the intricacies of how cells interact within the tumor and influence patient outcomes, the importance of analyzing heterogeneous cells across the tumor microenvironment has also increased. Multiome sequencing, which permits the acquisition of single cell RNA and attack sequencing from the same cell in a paired cell fashion provides a significant advance towards this end. However, the quality of the data obtained from these experiments is highly dependent on the quality of the experimental conditions and inputted biological material.This protocol provides a reliable and optimized approach to the isolation of nuclei from solid tumor specimens for multiome sequencing using the 10x Genomics platform. This protocol is reliable using either fresh or frozen single cell suspensions. We provide recommendations for tissue dissociation conditions, cryopreservation of single cell suspensions, and assessment of isolated nuclei.In this protocol, we used human pancreatic ductal adenocarcinoma specimens, which are a primary tissue type of focus in our laboratory. Pancreas cancer represents a highly desmoplastic tumor type, which portends relatively sticky tissue as well as cells. Moreover, as pancreatic tumor specimens available for research also tend to be relatively small, efforts are made to maximize the quantity of the cells captured.

Çoklu dizileme için hasta katı tümör örneklerinden yüksek kaliteli çekirdekleri izole etmek için (Şekil 1), tümör dokusu ayrıştı ve tek hücreli bir süspansiyon dondurularak saklandı (Şekil 2A-D). Hücre süspansiyonu daha sonra planlanan multiom yakalama sırasında çözüldü. Çekirdek yakalama, hem kaliteyi hem de verimi en üst düzeye çıkarmak için optimize edilmiş lizis tampon reaktifleri ve zamanla...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Enhancing Nuclei Isolation for Multiome Sequencing in Challenging Tumor Microenvironments at JoVE.com

Protokol, doku ayrışma koşulları, tek hücreli süspansiyonların dondurularak saklanması ve izole çekirdeklerin değerlendirilmesi dahil olmak üzere 10x Genomik platformunu kullanarak çoklu dizileme için katı tümör örneklerinden çekirdeklerin izolasyonuna güvenilir ve optimize edilmiş bir yaklaşım sağlar.

Multiome sequencing, which provides same-cell/paired single-cell RNA- and the assay for transposase-accessible chromatin with sequencing (ATAC-sequencing) ...

Tümör biyolojisi hakkındaki bilgimiz arttıkça ve hücrelerin tümör içinde nasıl etkileşime girdiğinin ve hasta sonuçlarını nasıl etkilediğinin inceliklerini anlamaya olan ilgimiz arttıkça, tümör mikroçevresindeki heterojen hücreleri analiz etmenin önemi de artmıştır. Tek hücreli RNA'nın elde edilmesine ve aynı hücreden eşleştirilmiş hücre tarzında saldırı dizilimine izin veren çoklu dizileme, bu amaca yönelik önemli bir ilerleme sağlar. Bununla birlikte, bu deneylerden elde edilen verilerin kalitesi, deney koşullarının ve girilen biyolojik materyalin kalitesine büyük ölçüde bağlıdır.Bu protokol, 10x Genomics platformunu kullanarak çoklu dizileme için katı tümör örneklerinden çekirdeklerin izolasyonuna güvenilir ve optimize edilmiş bir yaklaşım sağlar. Bu protokol, taze veya dondurulmuş tek hücreli süspansiyonlar kullanılarak güvenilirdir. Doku ayrışma koşulları, tek hücreli süspansiyonların dondurularak saklanması ve izole çekirdeklerin değerlendirilmesi için öneriler sunuyoruz.Bu protokolde laboratuvarımızda primer doku tipi olan insan pankreatik duktal adenokarsinom örnekleri kullanıldı. Pankreas kanseri, hücrelerin yanı sıra nispeten yapışkan dokuyu da taşıyan oldukça desmoplastik bir tümör tipini temsil eder. Ayrıca, araştırma için mevcut pankreas tümörü örnekleri de nispeten küçük olma eğiliminde olduğundan, yakalanan hücrelerin miktarını en üst düzeye çıkarmak için çaba sarf edilmektedir.

Çoklu Dizileme için Taze ve Dondurulmuş Katı Tümör Örneklerinden Optimize Edilmiş Çekirdek İzolasyonu

Abstract