Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הפרוטוקול מספק גישה אמינה ואופטימלית לבידוד גרעינים מדגימות גידולים מוצקים לצורך ריצוף מולטיומי באמצעות פלטפורמת 10x Genomics, כולל המלצות לתנאי דיסוציאציה של רקמות, שימור בהקפאה של תרחיפים חד-תאיים והערכה של גרעינים מבודדים.

Abstract

ריצוף מולטיום, המספק RNA חד-תאי זהה/מזווג והבדיקה עבור כרומטין נגיש לטרנספוזאז עם נתוני ריצוף (ATAC-sequencing), מייצג פריצת דרך ביכולתנו להבחין בהטרוגניות של תאי הגידול - מוקד עיקרי של מחקר סרטן תרגומי בשלב זה. עם זאת, איכות נתוני הרצף הנרכשים באמצעות מודל מתקדם זה תלויה מאוד באיכות חומר הקלט.

תנאי העיכול צריכים להיות אופטימליים כדי למקסם את תפוקת התאים מבלי להקריב את האיכות. זה מאתגר במיוחד בהקשר של גידולים מוצקים עם מטריצות דסמופלסטיות צפופות שיש לפרק בעדינות לשחרור תאים. תאים שבודדו טריים מרקמת גידול מוצקה הם שבירים יותר מאלה שבודדו משורות תאים. בנוסף, מכיוון שסוגי התאים המבודדים הם הטרוגניים, יש לבחור תנאים שיתמכו באוכלוסיית התאים הכוללת.

לבסוף, תנאי בידוד גרעיני חייבים להיות אופטימליים בהתבסס על תכונות אלה במונחים של זמני ליזה וסוגים/יחסים מגיבים. במאמר זה, אנו מתארים את הניסיון שלנו עם בידוד גרעיני עבור פלטפורמת ריצוף 10x Genomics multiome מדגימות גידול מוצק. אנו מספקים המלצות לעיכול רקמות, אחסון של תרחיפים חד-תאיים (אם רוצים), בידוד גרעיני והערכה.

Introduction

ככל שהידע שלנו על ביולוגיה של הגידול גדל, החשיבות של ניתוח תאים הטרוגניים על פני מיקרו-סביבה של הגידול גדלה גם היא 1,2. היכולת לרכוש RNA חד-תאי והבדיקה לכרומטין נגיש לטרנספוזאז עם נתוני ריצוף (ATAC-sequencing) מאותו תא בצורה זוגית (ריצוף מולטיום) מספקת התקדמות משמעותית לקראת מטרה זו 3,4. עם זאת, ניסויים אלה יקרים וגוזלים זמן, ואיכות וההשפעה של הנתונים המתקבלים תלויים מאוד באיכות תנאי הניסוי והחומרים. פרוטוקולים סטנדרטיים לבידוד גרעינים פורסמו 5,6. רקמות טריות והטרוגניות דורשות אופטימיזציה של פר....

Protocol

דגימות סרטן הלבלב האנושי (אדנוקרצינומה של צינור הלבלב) נרכשו על פי פרוטוקול שאושר על ידי IRB במעבדה שלנו. התקבלה הסכמה מדעת של המטופלים לאיסוף רקמות. הרקמה הועברה מחדר הניתוח למעבדה ולאחר מכן טופלה באופן הבא.

1. דיסוציאציה רקמות (עיכול)

  1. הכן את מאגר Digest (ראה טב.......

Representative Results

כדי לבודד גרעינים באיכות גבוהה מדגימות של גידולים מוצקים של מטופלים לצורך ריצוף מולטיומי (איור 1), רקמת הגידול נותקה ותרחיף של תא בודד נשמר בהקפאה (איור 2A-D). לאחר מכן הופשר מתלה התא בזמן לכידת המולטיום המתוכננת. לכידת גרעינים בוצעה עם ריאגנ.......

Discussion

התרת הסבך של אוכלוסיות התאים ההטרוגניות הקיימות במיקרו-סביבה של הגידול היא תחום פעיל של התמקדות בביולוגיה של סרטן. באופן דומה, רקמות מורכבות קיימות בפתולוגיות שפירות כגון ריפוי פצעים ופיברוזיס. ריצוף Multiome התגלה ככלי רב עוצמה המאפשר רכישה של נתוני scRNA ו- ATAC-seq מזווגים של תאים זהים. פרוטוקול .......

Acknowledgements

ברצוננו להודות למתקן הגנומיקה הפונקציונלית של סטנפורד (SFGF), במיוחד לדהננג'אי וואג וג'ון קולר, ול-10x Genomics על עזרתם במיטוב הניסויים שלנו. ברצוננו גם להודות לד"ר ג'ורג' פולטסיידס, מוניקה דואה, ברנדן ויסר ובירן לי על עזרתם בהשגת דגימות מטופלים. ברצוננו להודות לארט ולאיליין טיילור, קרן רנץ, וורן וג'ודי קפלן על תמיכתם הנדיבה במאמצי המחקר שלנו. מקורות המימון כוללים מענקי NIH 1F32CA23931201A1 (D.S.F.), 1R01GM116892 (M.T.L.), 1R01GM136659 (M.T.L.), קרן גולדמן זאקס (J.A.N., D.S.F., M.T.L.), הקרן לחקר הסרטן ע"ש דיימון ראניון (D.D., M.T.L.), קרן גאן/אוליבייה, המכון לרפואה רגנרטיבית בקליפורניה, קרן סטיינהרט/ריד ומעבדת הייגי לרפואה רגנרטיבית בילדים. הריצוף הושג באמצעות מכונו....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
100, 70, and 40 μm Falcon cell strainers  ThermoFisher
10x Genomics Nuclei Buffer (20x)10x Genomics2000153/2000207
Bambanker Wako, Fisher ScientiticNC9582225 
BSAMiltenyi Biotec130-091-376
Calcium ChlorideSigma Aldrich499609
Collagenase (Collagenase Type IV)ThermoFisher17104019
DigitoninThermo FisherBN2006
DNase IWorthingtonLS006330
DTTSigma Aldrich646563
Dulbecco’s Modified Eagle Medium F-12Thermo Fisher11320082
Fetal Bovine SerumThermo Fisher10438026
Flowmi 40 μm  Pipette Tip Cell Strainer Sigma AldrichBAH136800040
HEPESSigma AldrichH3375
Histopaque-1119 Gradient Cell Separation solutionSigma Aldrich11191
Medium 199Sigma AldrichM2520
MgCl2Sigma AldrichM1028
Miltenyi GentleMACSTM digest kit 
NaClSigma Aldrich59222C
Nalgene Cryo "Mr. Frosty" Freezing Container ThermoFisher5100-0001
Nonident P40 SubstituteSigma Aldrich74385
Poloxamer 188SigmaP5556
Rnase inhibitor Sigma Aldrich3335399001
Tris-HClSigma AldrichT2194
Tween-20Thermo Fisher85113

References

Explore More Articles

RNAATAC10 Multiome

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved