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Il protocollo fornisce un approccio affidabile e ottimizzato all'isolamento dei nuclei da campioni di tumore solido per il sequenziamento multioma utilizzando la piattaforma 10x Genomics, comprese le raccomandazioni per le condizioni di dissociazione tissutale, la crioconservazione delle sospensioni a singola cellula e la valutazione dei nuclei isolati.
Il sequenziamento multiomico, che fornisce RNA a singola cellula/appaiata e il saggio per la cromatina accessibile alla trasposasi con dati di sequenziamento (sequenziamento ATAC), rappresenta una svolta nella nostra capacità di discernere l'eterogeneità delle cellule tumorali, un obiettivo primario della ricerca traslazionale sul cancro in questo momento. Tuttavia, la qualità dei dati di sequenziamento acquisiti utilizzando questa modalità avanzata dipende in larga misura dalla qualità del materiale in ingresso.
Le condizioni di digestione devono essere ottimizzate per massimizzare la resa cellulare senza sacrificare la qualità. Ciò è particolarmente impegnativo nel contesto di tumori solidi con matrici desmoplastiche dense che devono essere delicatamente scomposte per il rilascio cellulare. Le cellule appena isolate da tessuto tumorale solido sono più fragili di quelle isolate da linee cellulari. Inoltre, poiché i tipi di cellule isolate sono eterogenei, è necessario selezionare le condizioni per supportare la popolazione cellulare totale.
Infine, le condizioni di isolamento nucleare devono essere ottimizzate in base a queste qualità in termini di tempi di lisi e tipi/rapporti di reagenti. In questo articolo, descriviamo la nostra esperienza con l'isolamento nucleare per la piattaforma di sequenziamento multioma 10x Genomics da campioni di tumore solido. Forniamo raccomandazioni per la digestione tissutale, la conservazione di sospensioni unicellulari (se lo si desidera) e l'isolamento e la valutazione nucleare.
Con l'aumento della nostra conoscenza della biologia dei tumori, è aumentata anche l'importanza di analizzare cellule eterogenee nel microambiente tumorale 1,2. La capacità di acquisire RNA a singola cellula e il saggio per la cromatina accessibile alla trasposasi con dati di sequenziamento (sequenziamento ATAC) dalla stessa cellula in modo accoppiato (sequenziamento multiomico) fornisce un progresso significativo verso questo obiettivo 3,4. Tuttavia, questi esperimenti sono costosi e richiedono molto tempo e la qualità e l'impatto dei dati acquisiti d....
I campioni di carcinoma pancreatico umano (adenocarcinoma duttale pancreatico) sono stati acquisiti secondo un protocollo approvato dall'IRB nel nostro laboratorio. È stato ottenuto il consenso informato dei pazienti per la raccolta dei tessuti. Il tessuto è stato trasportato dalla sala operatoria al laboratorio e poi processato come segue.
1. Dissociazione tissutale (digestione)
Per isolare nuclei di alta qualità da campioni di tumori solidi di pazienti per il sequenziamento del multioma (Figura 1), il tessuto tumorale è stato dissociato e una sospensione a singola cellula è stata crioconservata (Figura 2A-D). La sospensione cellulare è stata poi scongelata al momento della cattura pianificata del multioma. La cattura dei nuclei è stata condotta con reagenti tampone di lisi ottimizzati e tempistich.......
Districare le popolazioni cellulari eterogenee presenti nel microambiente tumorale è un'area di interesse attiva nella biologia del cancro. Allo stesso modo, i tessuti complessi esistono in patologie benigne come la guarigione delle ferite e la fibrosi. Il sequenziamento multioma è emerso come un potente strumento che consente l'acquisizione di dati scRNA- e ATAC-seq accoppiati nella stessa cellula. Questo protocollo descrive l'isolamento dei nuclei, che richiede un'ottimizzazione nell'ambito dell'elaborazione di campi.......
Vorremmo ringraziare la Stanford Functional Genomics Facility (SFGF), in particolare Dhananjay Wagh e John Coller, e 10x Genomics per la loro assistenza nell'ottimizzazione dei nostri esperimenti. Vorremmo anche ringraziare i dottori George Poultsides, Monica Dua, Brendan Visser e Byrne Lee per la loro assistenza nell'acquisizione di campioni di pazienti. Vorremmo ringraziare Art ed Elaine Taylor, la Rantz Foundation, e Warren e Judy Kaplan per il loro generoso sostegno ai nostri sforzi di ricerca. Le fonti di finanziamento includono le sovvenzioni NIH 1F32CA23931201A1 (DSF), 1R01GM116892 (M.T.L.), 1R01GM136659 (M.T.L.), Goldman Sachs Foundation (J.A.N., D.S.F., M.T.L....
Name | Company | Catalog Number | Comments |
100, 70, and 40 μm Falcon cell strainers | ThermoFisher | ||
10x Genomics Nuclei Buffer (20x) | 10x Genomics | 2000153/2000207 | |
Bambanker | Wako, Fisher Scientitic | NC9582225 | |
BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
Calcium Chloride | Sigma Aldrich | 499609 | |
Collagenase (Collagenase Type IV) | ThermoFisher | 17104019 | |
Digitonin | Thermo Fisher | BN2006 | |
DNase I | Worthington | LS006330 | |
DTT | Sigma Aldrich | 646563 | |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium F-12 | Thermo Fisher | 11320082 | |
Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10438026 | |
Flowmi 40 μm Pipette Tip Cell Strainer | Sigma Aldrich | BAH136800040 | |
HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
Histopaque-1119 Gradient Cell Separation solution | Sigma Aldrich | 11191 | |
Medium 199 | Sigma Aldrich | M2520 | |
MgCl2 | Sigma Aldrich | M1028 | |
Miltenyi GentleMACSTM digest kit | |||
NaCl | Sigma Aldrich | 59222C | |
Nalgene Cryo "Mr. Frosty" Freezing Container | ThermoFisher | 5100-0001 | |
Nonident P40 Substitute | Sigma Aldrich | 74385 | |
Poloxamer 188 | Sigma | P5556 | |
Rnase inhibitor | Sigma Aldrich | 3335399001 | |
Tris-HCl | Sigma Aldrich | T2194 | |
Tween-20 | Thermo Fisher | 85113 |
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