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In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Este protocolo demonstra isolamento guiado por microscopia e coloração por imunofluorescência de veias pulmonares murinas. Preparamos amostras de tecido contendo o átrio esquerdo, veias pulmonares e pulmões correspondentes e as coramos para troponina cardíaca T e Conexina 43.

Abstract

As veias pulmonares (VVPs) são a principal fonte de batimentos ectópicos nas arritmias atriais e desempenham um papel crucial no desenvolvimento e progressão da fibrilação atrial (FA). As VPs contêm mangas miocárdicas (SM) compostas por cardiomiócitos. A SM está implicada no início e manutenção da FA, pois preserva semelhanças com o miocárdio cardíaco de trabalho, incluindo a capacidade de gerar impulsos elétricos ectópicos. Os roedores são amplamente utilizados e podem representar excelentes modelos animais para o estudo do miocárdio da veia pulmonar, uma vez que os cardiomiócitos estão amplamente presentes em toda a parede do vaso. No entanto, a microdissecção precisa e a preparação de PVs murinos são desafiadoras devido ao pequeno tamanho do órgão e à intrincada anatomia.

Demonstramos um protocolo de microdissecção guiado por microscopia para isolar o átrio esquerdo (AE) murino juntamente com as VVPPs. A coloração por imunofluorescência usando anticorpos cardíacos Troponina-T (cTNT) e conexina 43 (Cx43) é realizada para visualizar o AE e as VPs em toda a extensão. A aquisição de imagens em aumentos de 10x e 40x fornece uma visão abrangente da estrutura das VVPN, bem como informações detalhadas sobre a arquitetura miocárdica, destacando particularmente a presença de conexina 43 dentro da EM.

Introduction

A fibrilação atrial (FA) é a arritmia sustentada mais comum1. A prevalência da FA está aumentando ainda mais, com um número esperado de ~17,9 milhões de pacientes na Europa em 20601. A FA é clinicamente de grande importância, pois é um fator de risco essencial para o desenvolvimento de infarto do miocárdio, insuficiência cardíaca ou acidente vascular cerebral, resultando em uma enorme carga individual, social e socioeconômica1. Embora a FA seja conhecida há décadas, a fisiopatologia da FA ainda não étotalmente compreendida2.

Já no final da década....

Protocol

Os cuidados com os animais e todos os procedimentos experimentais foram conduzidos seguindo as diretrizes do Comitê de Ética e Cuidados com Animais da Ludwig-Maximilians-University of Munich, e todos os procedimentos com camundongos foram aprovados pelo Regierung von Oberbayern (ROB 55.2-2532. Vet_02-20-215, ROB 55.2-2532. Vet_02-18-46, ROB 55.2-2532. Vet_02-19-86, ROB 55.2-2532. Vet_02-21-178, ROB 55.2-2532. Vet_02-22-170). Camundongos C57BL6/N foram obtidos comercialmente.

1. Preparo.......

Representative Results

Realizamos a microdissecção, coloração e imagem das VPs em 10 camundongos de 12-16 semanas de idade. Seguindo o protocolo, microdissecamos com sucesso as VPs juntamente com o AL em todos os camundongos experimentais e obtivemos cortes com uma visão abrangente das VPs em oito camundongos. As imagens de visão geral foram obtidas em aumento de 10x para identificar a região do orifício das VVP (PVO) na junção AE-PV, as VPs extrapulmonares (PVex) (VPs entre o hilo pulmonar e a junção AE-PV) e as VVP int.......

Discussion

Com esse protocolo, compartilhamos um método para distinguir e isolar os PVs do coração de camundongos e realizar a coloração de imunofluorescência neles. Após a retirada dos órgãos, o coração e os pulmões foram desidratados em solução de sacarose esterilizada, seguindo-se a separação dos ventrículos do átrio e dos lobos pulmonares sob orientação microscópica. Em seguida, a base do coração foi preparada para visualizar as VVPP e cortá-las dos pulmões no hilo. A coloração subsequente por imunofl.......

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pelo Centro Alemão de Pesquisa Cardiovascular (DZHK; 81X3600221to H.V., 81X2600255 to S.C.), pelo China Scholarship Council (CSC201808130158 a R.X.), pela Fundação Alemã de Pesquisa (DFG; Programa de Cientista Clínico em Medicina Vascular (PRIME), MA 2186/14-1 a P. T.), e a Fundação Corona (S199/10079/2019 a S. C.).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Adhesion slidesEpredia10149870
AF568-secondary antibodyInvitrogenA11036Host: Goat, Reactivity: Rabbit
AgaroseBiozym LE840104
Alexa Fluor 488-secondary antibodyCell Signaling Technology4408SHost: Goat, Reactivity: Mouse
Anti-Connexin 43 /GJA1 antibodyAbcamab11370Polyclonal Antibody, Clone: GJA1, Host: Rabbit 
Anti-cTNT antibodyInvitrogenMA5-12960Monoclonal Antibody, Clone: 13-11, Host: Mouse
Bovine serum albuminSigma-AldrichA2153
BrushLukas 5486size 6
Cover slipsEpredia24 mm x 50 mm
Cryotome Cryo Star NX70Epredia Settings: Specimen temperature: -18 °C, Blade Temperature: -25 °C
DFC365FX cameraLeica 
DM6 B fluorescence microscopeLeica 
Dry ice
Dubecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 1x conc.Gibco14040133500 mL
Dumont #5FS ForcepsF.S.T.91150-202 pieces needed
Fine ScissorsF.S.T.14090-09
Fluorescence mounting mediumDAKOS3023
Graefe ForcepsF.S.T.11052-10
Hoechst 33342InvitrogenH3570Cell nuclei counterstaining
ImageJFIJIanalysis and processing software
LAS XLeica Imaging software for Leica DM6 B
Microtome blades S35Feather207500000
Microwave
Normal goat serumSigma-AldrichS26-M
O.C.T. compoundTissue-Tek4583
Paraformaldehyde 16%Pierce28908methanol-free
Pasteur pipettesVWR612-1681
Petri dishTPP93100100 mm diameter
Rocker 3D digitalIKA Schüttler00040010000
Slide staining jarsEasyDipM900-12
Specimen MoldsTissue-Tek Cryomold455725 mm x 20 mm x 5 mm
StainTray M920 staining systemStainTray631-1923Staining system for 20 slides
Sterican NeedleBraun4657705G 27 - used for injection (step 2) and pinning (step 3 and 4) in the protocol
Student Vannas Spring ScissorsF.S.T.91500-09
Super PAP Pen Liquid BlockerSuper PAP PenN71310-N
SyringesBraun4606108V10 mL
Tris baseRocheTRIS-ROcomponent for 1x Tris-Buffered Saline (TBS)
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
Tween 20Sigma-AldrichP2287

References

  1. Lippi, G., Sanchis-Gomar, F., Cervellin, G. Global epidemiology of atrial fibrillation: An increasing epidemic and public health challenge. International Journal of Stroke. 16 (2), 217-221 (2021).
  2. Wijesurendra, R. S., Casadei, B.

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