Microdissecção e Coloração por Imunofluorescência de Mangas Miocárdicas em Veias Pulmonares Murinas

Summary

Este protocolo demonstra isolamento guiado por microscopia e coloração por imunofluorescência de veias pulmonares murinas. Preparamos amostras de tecido contendo o átrio esquerdo, veias pulmonares e pulmões correspondentes e as coramos para troponina cardíaca T e Conexina 43.

Abstract

As veias pulmonares (VVPs) são a principal fonte de batimentos ectópicos nas arritmias atriais e desempenham um papel crucial no desenvolvimento e progressão da fibrilação atrial (FA). As VPs contêm mangas miocárdicas (SM) compostas por cardiomiócitos. A SM está implicada no início e manutenção da FA, pois preserva semelhanças com o miocárdio cardíaco de trabalho, incluindo a capacidade de gerar impulsos elétricos ectópicos. Os roedores são amplamente utilizados e podem representar excelentes modelos animais para o estudo do miocárdio da veia pulmonar, uma vez que os cardiomiócitos estão amplamente presentes em toda a parede do vaso. No entanto, a microdissecção precisa e a preparação de PVs murinos são desafiadoras devido ao pequeno tamanho do órgão e à intrincada anatomia.

Demonstramos um protocolo de microdissecção guiado por microscopia para isolar o átrio esquerdo (AE) murino juntamente com as VVPPs. A coloração por imunofluorescência usando anticorpos cardíacos Troponina-T (cTNT) e conexina 43 (Cx43) é realizada para visualizar o AE e as VPs em toda a extensão. A aquisição de imagens em aumentos de 10x e 40x fornece uma visão abrangente da estrutura das VVPN, bem como informações detalhadas sobre a arquitetura miocárdica, destacando particularmente a presença de conexina 43 dentro da EM.

Introduction

A fibrilação atrial (FA) é a arritmia sustentada mais comum¹. A prevalência da FA está aumentando ainda mais, com um número esperado de ~17,9 milhões de pacientes na Europa em 2060¹. A FA é clinicamente de grande importância, pois é um fator de risco essencial para o desenvolvimento de infarto do miocárdio, insuficiência cardíaca ou acidente vascular cerebral, resultando em uma enorme carga individual, social e socioeconômica¹. Embora a FA seja conhecida há décadas, a fisiopatologia da FA ainda não é^{totalmente compreendida2}.

Já no final da década....

Protocol

Os cuidados com os animais e todos os procedimentos experimentais foram conduzidos seguindo as diretrizes do Comitê de Ética e Cuidados com Animais da Ludwig-Maximilians-University of Munich, e todos os procedimentos com camundongos foram aprovados pelo Regierung von Oberbayern (ROB 55.2-2532. Vet_02-20-215, ROB 55.2-2532. Vet_02-18-46, ROB 55.2-2532. Vet_02-19-86, ROB 55.2-2532. Vet_02-21-178, ROB 55.2-2532. Vet_02-22-170). Camundongos C57BL6/N foram obtidos comercialmente.

1. Preparo.......

Discussion

Com esse protocolo, compartilhamos um método para distinguir e isolar os PVs do coração de camundongos e realizar a coloração de imunofluorescência neles. Após a retirada dos órgãos, o coração e os pulmões foram desidratados em solução de sacarose esterilizada, seguindo-se a separação dos ventrículos do átrio e dos lobos pulmonares sob orientação microscópica. Em seguida, a base do coração foi preparada para visualizar as VVPP e cortá-las dos pulmões no hilo. A coloração subsequente por imunofl.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesion slides	Epredia	10149870
AF568-secondary antibody	Invitrogen	A11036	Host: Goat, Reactivity: Rabbit
Agarose	Biozym LE	840104
Alexa Fluor 488-secondary antibody	Cell Signaling Technology	4408S	Host: Goat, Reactivity: Mouse
Anti-Connexin 43 /GJA1 antibody	Abcam	ab11370	Polyclonal Antibody, Clone: GJA1, Host: Rabbit
Anti-cTNT antibody	Invitrogen	MA5-12960	Monoclonal Antibody, Clone: 13-11, Host: Mouse
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A2153
Brush	Lukas	5486	size 6
Cover slips	Epredia		24 mm x 50 mm
Cryotome Cryo Star NX70	Epredia		Settings: Specimen temperature: -18 °C, Blade Temperature: -25 °C
DFC365FX camera	Leica
DM6 B fluorescence microscope	Leica
Dry ice
Dubecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 1x conc.	Gibco	14040133	500 mL
Dumont #5FS Forceps	F.S.T.	91150-20	2 pieces needed
Fine Scissors	F.S.T.	14090-09
Fluorescence mounting medium	DAKO	S3023
Graefe Forceps	F.S.T.	11052-10
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570	Cell nuclei counterstaining
ImageJ	FIJI		analysis and processing software
LAS X	Leica		Imaging software for Leica DM6 B
Microtome blades S35	Feather	207500000
Microwave
Normal goat serum	Sigma-Aldrich	S26-M
O.C.T. compound	Tissue-Tek	4583
Paraformaldehyde 16%	Pierce	28908	methanol-free
Pasteur pipettes	VWR	612-1681
Petri dish	TPP	93100	100 mm diameter
Rocker 3D digital	IKA Schüttler	00040010000
Slide staining jars	EasyDip	M900-12
Specimen Molds	Tissue-Tek Cryomold	4557	25 mm x 20 mm x 5 mm
StainTray M920 staining system	StainTray	631-1923	Staining system for 20 slides
Sterican Needle	Braun	4657705	G 27 - used for injection (step 2) and pinning (step 3 and 4) in the protocol
Student Vannas Spring Scissors	F.S.T.	91500-09
Super PAP Pen Liquid Blocker	Super PAP Pen	N71310-N
Syringes	Braun	4606108V	10 mL
Tris base	Roche	TRIS-RO	component for 1x Tris-Buffered Saline (TBS)
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Tween 20	Sigma-Aldrich	P2287